Innovative oenological biotechnology. In recent years, many winemakers have started to use pure wine yeast strains to produce wines of a quality that is easier to reproduce. The new molecular techniques used to type and identify micro-organisms mean that the implantation process of the yeast, chosen as a starter, can be controlled and its progress studied throughout fermentation of the must. Currently, commercial enzyme preparations are widely employed to improve technological processes such as pressing, filtering and fining and also to modify the organoleptical characteristics of wine, such as colour and aroma. The development of these biotechnological innovations has opened the door to genetic modification of wine yeasts and the expression of valuable characteristics, which improve the process of winemaking and the sensorial characteristics of the resulting wines.

L’home ha produït vi i altres aliments fermentats com el pa, la cervesa o certs derivats lactis des de temps molt remots. Les restes arqueològiques relacionades amb l’elaboració del vi més antigues que es coneixen daten de fa uns sis mil·lennis. Això implica que la biotecnologia, és a dir, la utilització d’organismes vius o de les seues parts en processos industrials, és quasi tan antiga com l’home, encara que, durant la major part de la història, la base d’aquestes pràctiques biotecnològiques fóra purament empírica. Avui dia, a causa principalment dels avenços científics dels darrers 150 anys, el coneixement empíric va sent reemplaçat per un coneixement adequat dels processos que regeixen aquestes transformacions biotecnològiques. A més, la revolució provocada en l’últim quart de segle pel desenvolupament de les tècniques de la biologia molecular i el DNA recombinant ha obert multitud de possibilitats noves per a controlar els processos biotecnològics i millorar els productes elaborats.

--- SELECCIÓ DE LLEVATS

El llevat responsable de la major part de la transformació del sucre del most de raïm en etanol durant l’elaboració del vi és Saccharomyces cerevistae (Figura 1). Això no obstant, quan el raïm arriba al celler després de la verema, moltes espècies més de llevats hi són presents (a més de fongs filamentosos, bacteris i virus) i normalment, en major nombre que S. cerevisiae. ües canviants condicions meteorològiques, entre altres factors, provoquen una gran variabilitat de la qualitat i quantitat de la microbiota de llevats present en el raïm durant les successives campanyes. Aquest problema es pot resoldre addicionant al most un cultiu iniciador de llevats seleccionats que normalitzen la microbiota inicial i, d’aquesta manera, que done lloc a una fermentació homogènia any rere any. Encara que els conreus líquids de llevats vínics han estat utilitzats des del 1930 (Instituý Laclaire, França), els llevats vínics secs actius no es van introduir fins mitjan anys cinquanta i el seu ús no es va estendre fins a finals de la dècada dels setanta. Des de llavors, en diverses zones d’Europa, EUA, Canadà, Sud-àfrica i Austràlia es porten a terme fermentacions utilitzant aquests llevats com a iniciadors de la fermentació. Les característiques que se li exigeixen a un llevat seleccionat són, principalment, que produesca fermentacions vigoroses, reproduïbles, predicibles i amb baixa ýoncentració de sucre residual, que posseesca una bona tolerància a l’etanol, a la temperatura i a l’anhídrid sulfurós, que produesca un bon perfil aromàtic exempt d’aromes no desitjades i, sobretot en l’elaboració d’escumosos, que flocule i sedimente espontàniament perquè siga fàcil d’eliminar una vegada acabada la seua funció.

--- MÈTODES MOLECULARS D’IDENTIFICACIÓ

Arran de l’ús de llevats seleccionats com a pràctica habitual en molts cellers, inevitablement es va plantejar un interrogant important. Com saber si la inoculació ha reexit i el llevat addicionat condueix la fermentació i transmet al vi les característiques per les quals va ser seleccionat? Les tècniques clàssiques d’identificació, basades en les característiques morfològiques i fisiològiques, a banda de ser lentes, no podien contestar aquesta qüestió perquè eren incapaces de discernir entre les nombroses soques de l’espècie S. cerevisiae presents en el most o vi i, per tant el llevat seleccionat es feia indistingible de la resta. El problema es va resoldre amb l’ús dels mètodes moleculars d’identificació. En concret, utilitzar certs enzims de restricció que tallen selectivament el DNA i separar posteriorment els fragments resultants en gels d’agarosa va permetre obtenir patrons de bandes corresponents a fragments del DNA mitocondrial dels llevats. Aquests patrons resultaren ser distints entre les distintes soques de llevats vínics i, per tant, la tècnica va permetre de conèixer de manera ràpida quins ceps i en quines proporcions es troben en cada moment creixent en els fermentadors (Figura 2). Aquesta eina d’identificació permet, a més, realitzar una anàlisi dels distints llevats comercials que es troben en el mercat i comprovar si les soques que es venen com a distintes ho són en realitat, cosa que ajuda a detectar els fraus que no fa gaire temps passaven desapercebuts. A més d’aquesta tècnica, n’hi ha d’altres l’aplicabilitat de les quals varia en funció dels objectius que es perseguesquen. Per exemple, la separació dels cromosomes (cariotips) en funció de la seua migració electroforètica en gels d’agarosa pot ser igualment útil per a diferenciar entre distintes soques de S. cerevisie, i la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) per a amplificar selectivament fragments del DNA ribosomal es fa servir per a diferenciar entre distints gèneres i espècies dels llevats que formen part de la microbiota natural del raïm i el vi.
L’aplicació d’aquesta mena de tècniques es va imposant amb rapidesa als cellers perquè permeten un control microbiològic del procés fermentatiu més ràpid i efectiu, sobretot quan s’utilitzen llevats seleccionats per produir vins de característiques homogènies any rere any.

--- ÚS D’ENZIMS EN ENOLOGIA

Els enzims són additius alimentaris d’utilització freqüent en gairebé qualsevol aliment processat i el vi no n’és cap excepció. La utilització d’enzims en enologia es va desenvolupar a partir de la dècada dels 70 i, actualment, la major part dels preparats enzimàtics comercials que es fan servir en enologia provenen de cultius del fong Aspergillus niger. Els avenços en les tècniques de l’enginyeria genètica i de processos han permès produir enzims més purs i en major quantitat. A més, mitjançant enginyeria de proteïnes, és possible optimitzar algunes de les propietats dels enzims abans de produir-los.
Els preparats enzimàtics d’utilitat en enologia que es poden trobar en el mercat varien en funció del fi que es perseguesca. Les glucanases es fan servir per a resoldre problemes de filtratge i clarificació originats pel b-glicà i les pectinases per a disminuir la viscositat en hidrolitzar les pectines i així provocar un augment de rendiment en suc després del premsatge i també afavorir el filtratge i la clarificació.
Els anomentats enzims de maceració són còctels enzimàtics compostos fonamentalment per pectinases, cel·lulases i hemicel·lulases que pretenen aconseguir els efectes ja esmentats de les pectinases i la degradació dels polisacàrids de les parets cel·lulars del gra de raïm exercida per les cel·lulases i hemicel·lulases. Amb l’addició d’aquests preparats durant la maceració (Figura 3) s’aconsegueix, a més d’un guany en el rendiment en suc després del premsatge, incrementar les velocitats de clarificació i sedimentació, una millor extracció del color dels vins negres, augmentar l’aroma i el sabor i un millor envelliment gràcies a increments en tanins i proantocianidines.
La pràctica totalitat dels preparats enzimàtics que es comercialitzen actualment posseeixen, en major o menor mesura, un altre tipus d’enzims denominats globalment glicosídics. El paper d’aquestes activitats glicosídiques és augmentar i millorar les aromes varietals dels vins. Això és possible perquè els components de l’aroma del raïm consisteixen en compostos volàtils lliures i conjugats amb sucres. Les activitats glicosídiques, seguint un esquema en dos passos, són capaces de trencar els enllaços que uneixen els compostos de l’aroma als sucres i, per tant, augmentar la fracció volàtil lliure amb la consegüent millora organolèptica.
L’ús d’enzims en enologia ha experimentat importants canvis en la darrera dècada i són nombrosos els camps oberts en la investigació de noves activitats enzimàtiques com ara proteases per a aconseguir l’estabilitat proteica dels vins, fenoloxidases per a estabilitzar el color en vins blancs, glucosa oxidasa per a obtenir vins amb baix contingut en etanol o els enzims implicats en la síntesi d’èsters, compostos de summa importància en l’aroma afruitada dels vins.

--- MODIFICACIÓ GENÈTICA

L’ús de llevats seleccionats que s’inoculen en els mostos per iniciar i conduir la fermentació alcohòlica imposant-se a la resta de llevats presents, juntament amb el major coneixement molecular d’algunes rutes bioquímiques d’interès biotecnològic, ha permès fer enginyeria genètica dels llevats vínics. El raonament és simple: la introducció d’un o d’uns quants gens exògens en els llevats implica la producció d’una o de diverses noves característiques d’interès industrial. La seua inoculació i imposició posterior assegura l’expressió de les dites característiques al llarg del procés fermentatiu i, per tant, el seu efecte en el producte final.
Per a poder modificar genèticament un organisme és necessari disposar d’un sistema de transformacions que permeta introduir-hi la informació genètica modificada in vitro. Durant els darrers anys s’han desenvolupat enormement els sistemes de transformació i s’ha aconseguit, finalment, construir llevats vínics recombinants que porten un nou gen o gens integrats en el genoma del llevat i que manquen dels gens de resistència a antibiòtics que s’han fet servir en els processos previs de manipulació. Una vegada som capaços d’introduir gens en els llevats vínics, el següent pas consisteix a aconseguir-ne l’expressió durant la vinificació. La regulació de l’expressió es pot modular de manera que els gens s’encenguen o s’apaguen en funció de determinades condicions fisiològiques o ambientals, cosa que permet, per tant, no solament que els gens s’expressen, sinó que ho facen en el moment més idoni del procés d’elaboració.
Amb les eines descrites, s’han obtingut diversos llevats vínics transgènics. Per a vins que presenten problemes de baixa acidesa s’han construït llevats que contenen un gen, aïllat de Lactobacillus casei, necessari per a produir àcid làctic. Aquest llevat transgènic és així capaç de portar a terme la fermentació làctica i l’alcohòlica, i de resoldre el problema. Per al cas contrari, és a dir, vins amb excessiva acidesa, s’han introduït en els llevats dos gens provinents de Lactococcus lactis i Schizosaccharomyces pombe, i s’ha aconseguit que el llevat modificat siga capaç de portar a terme la fermentació malolàctica, és a dir, la conversió de l’àcid màlic en àcid làctic, la qual es tradueix en una disminució de l’acidesa i una major estabilitat microbiològica del vi. Igualment s’han obtingut llevats transgènics que produeixen alguns dels enzims mencionats anteriorment, prestant especial interès a l’increment de les aromes varietals. Així, la inclusió en el llevat vínic dels gens que codifiquen enzims implicats en l’increment de l’aroma s’ha portat a terme amb èxit (Figura 4) i s’han obtingut vins en què s’ha comprovat l’augment en les aromes florals i afruitades. D’igual manera s’han produït en llevats vínics activitats enzimàtiques de maceració, com cel·lulases i hemicel·lulases, amb resultats comparables als obtinguts després de l’addició convencional dels preparats comercials durant la vinificació.
Actualment es continua investigant en camps com ara l’estudi dels gens que regulen la floculació dels llevats, la construcció dels llevats transgènics incapaços de produir urea o la modificació de les característiques metabòliques a fi d’optimitzar les taxes de fermentació i la producció de metabolits d’interès.
A més a més de la modificació genètica dels llevats vínics també s’estan produint importants avenços en la modificació genètica de la primera matèria, és a dir, la vinya. S’han aconseguit sistemes eficients de transformació que permeten introduir gens exògens en la vinya i, en una primera aproximació, s’ha investigat en la producció de plantes resistents a certes malalties víriques i fúngiques. En el futur, a mesura que s’obtinguen nous coneixements sobre les rutes metabòliques i la seua regulació en les plantes, serà possible abordar amb èxit qüestions com ara la modificació de la composició fenòlica del raïm, important per a produir vins envellits de qualitat, o la millora genètica de les propietats nutricionals o organolèptiques.
La tècnica del DNA recombinant ha canviat en pocs anys el panorama de la biotecnologia i ha possibilitat èxits impensables fa unes quantes dècades. Això no obstant, no s’hauria de llançar el missatge que ara tot és possible. De fet, no serveix de res l’eýginyeria genètica quan es desconeix la fisiologia i l’engranatge metabòlic dels organismes que es volen modificar. No és casualitat que els primers èxits industrials de l’enginyeria genètica s’hagen produït en la millora dels processos en què més ciència bàsica s’havia acumulat durant els darrers anys. En la mesura en què avance la ciència i el coneixement bàsic, podrem abordar la millora genètica dels organismes i, des d’aquest punt de vista, estem en el començament, perquè encara és immensa la nostra ignorància.

-