Identificación y caracterización biotecnológica de especies de hongos filamentosos de interés agroalimentario (RM03-008-C3-2)
El objetivo general de este proyecto ha sido la consolidación de una colección de hongos filamentosos de relevancia en la industria agroalimentaria en la que cada ejemplar se encuentre identificado, tanto a nivel molecular, como en su posible uso como microorganismo productor de algunos metabolitos y/o enzimas de relevancia agroalimentaria. Se ha usado como referencia y depositaria de las cepas estudiadas a la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT, Universidad de Valencia). El resultado conseguido ha sido doble: i) se ha incrementado el número de especies fúngicas presentes en la CECT, a la vez que se ha mejorado su tipificación molecular, estableciendo una caracterización que puede conducir a su posible utilización en agroalimentación; y ii) se ha contribuido en la preservación de la biodiversidad fúngica de interés agroalimentario presente en España y se ha concentrado en la CECT.
Los objetivos del proyecto fueron los siguientes:
- OBJETIVO 1: Establecimiento de una colección de partida que incluya cepas de distintas especies de los géneros Aspergillus, Paecilomyces y Trichoderma.
- OBJETIVO 2: Aplicación de métodos moleculares para la identificación a nivel de especie de todos y cada uno de los componentes de la colección definida en el objetivo 1.
- OBJETIVO 3: Escrutinio de la producción de distintas actividades enzimáticas de relevancia agroalimentaria en el listado de hongos filamentosos definido en el objetivo 1.
- OBJETIVO 4: Búsqueda e identificación molecular de nuevos aislados de los géneros Aspergillus, Paecilomyces y Trichoderma en nichos fríos (ecosistemas fríos y alimentos refrigerados). Detección de actividades enizmáticas de relevancia a bajas temperaturas.
- OBJETIVO 5: Construcción de una página de internet en el sitio web de la CECT-UV que muestre la catalogación de todas las cepas objeto de estudio en este proyecto, tanto las incluidas en el objetivo 1 como las obtenidas en el objetivo 4.
El presente proyecto ha sido coordinado entre cuatro instituciones:
- Universitat de València-Colección Española de Cultivos Tipo (UV-CECT). Entidad responsable
- Universidad de Salamanca (USAL)
- Universidad de Sevilla (USEV)
- Empresa NewBiotechnic, S.A. (NBT)
RESULTADOS ALCANZADOS EN EL PROYECTO
OBJETIVO 1: Establecimiento de una colección de partida que incluya cepas de distintas especies de los géneros Aspergillus, Paecilomyces y Trichoderma.
En las Tablas 1, 2 y 3 se recogen todas las cepas objeto de estudio del presente proyecto pertenecientes a los géneros mencionados anteriormente. Las referencias en negrita corresponden a las cepas de nueva incorporación en la CECT.
- Tabla 1. Listado de especies pertenecientes al género Aspergillus (46 cepas en total).
- Tabla 2. Listado de especies pertenecientes al género Paecilomyces (39 cepas en total).
- Tabla 3. Listado de especies pertenecientes al género Trichoderma y Bionectria pseudochroleuca (48 cepas en total).
OBJETIVO 2: Aplicación de métodos moleculares para la identificación a nivel de especie de todos y cada uno de los componentes de la colección definida en el objetivo 1.
Tradicionalmente en la identificación y caracterización de hongos filamentosos se han utilizado métodos morfológicos, que han consistido en una detallada observación microscópica y datos del crecimiento. Dada la complejidad de muchos de los caracteres estudiados y la gran variabilidad que éstos presentan, estas técnicas necesitan ser corroboradas por técnicas genético-moleculares que permitan identificar y caracterizar cualquier aislado, utilizando métodos rápidos, fiables y repetitivos.
En cumplimiento del objetivo 2, las técnicas moleculares utilizadas para la identificación a nivel de especies de todos y cada uno de los componentes de la colección definida en el objetivo 1 han sido las siguientes:
Para las especies pertenecientes a los géneros Aspergillus y Paecilomyces.
- Análisis de los fragmentos de restricción del DNA ribosómico (rDNA-RFLPs).
- Secuenciación del fragmento de amplificación que incluye las regiones ITS1, ITS2, y el gen que codifica el 5,8S rRNA.
Para las especies pertenecientes al género Trichoderma.
- Después de una aproximación a varios marcadores moleculares, se han estudiado las secuencias del espacio intergénico ITS1 del rDNA y las secuencias del factor de translación elongación 1a (tef1).
RESULTADOS
- Análisis de los fragmentos de restricción del DNA ribosómico (rDNA-RFLPs)
Se ha completado el estudio a nivel morfológico y molecular, utilizando las técnicas moleculares anteriormente citadas, de todas las cepas despositadas en la CECT pertenecientes los géneros Aspergillus y Paecilomyces.
De todas las cepas estudiadas pertenecientes a la especie Aspergillus niger, sólo tres de ellas (CECT 2089, CECT 2545 y CECT 2575) han sido reidentificadas como pertenecientes a la especie A. tubingensis. El resto de cepas pertenecientes a la especie A. niger presentan el patrón de restricción característico de la especie.
Respecto al género Paecilomyces, la aplicación de esta técnica nos ha permitido identificar a nivel molecular todas las cepas de las especies incluidas en el proyecto, excepto las cepas pertenecientes a las especies Byssochlamys fulva y Byssochlamys nivea.
- Secuenciación del fragmento de amplificación que incluye las regiones ITS1, ITS2 y el gen que codifica el 5,8S rRNA.
La comparación de las secuencias de la región amplificada con las existentes en las bases de datos del NCIB, nos ha permitido corroborar los resultados obtenidos con la técnica mencionada anteriormente.
Esta técnica nos ha permitido identificar las cepas pertenecientes a las especies Byssochlamys fulva y Byssochlamys nivea, que presentaban el mismo patrón por restricción del fragmento amplificado.
Los resultados de la comparación con las secuencias existentes en las bases de datos para todas las cepas estudiadas han arrojado porcentajes de identidad de entre el 99% y el 100% con las especies indicadas.
- Secuencias del espacio intergénico ITS1 del rDNA y del factor de translación elongación 1a (tef1).
Los alineamientos de estas secuencias proporcionaron 21 genotipos diferentes de ITS1 y 17 genotipos distintos de tef1.
Con toda esta información se generaron árboles filogenéticos y las estirpes analizadas se repartieron en tres de las cuatro secciones de Trichoderma. Más del 50% de las cepas de biocontrol estudiadas se agruparon en la T. sect. Pachybasium.; de éstas, un 81% quedó incluído en la especie T. harzianum y un 16% en T. virens. En la T. sect. Trichoderma se agrupó un 36% de las cepas: el 56% de ellas pertenecientes a T. asperellum y un 24% a T. viride, T. atroviride y T. koningii. Sólo el 10% de las cepas se incluyó en la T. sect. Longibrachiatum (especies tradicionalmente celulolíticas y poco explotadas como agentes de biocontrol). En un sentido amplio, las topologías de los árboles obtenidos con las secuencias ITS1 y tef1 son similares, aunque no idénticas y algunas cepas de biocontrol aparecen separadas en diferentes agrupamientos en función del marcador considerado. Teniendo en cuenta los árboles filogenéticos, basados en el parámetro NJ, se ha confirmado que el marcador ITS1 tiene menor valor discriminatorio que el gen tef1 para resolver taxones en el género Trichoderma y que éste a su vez es mejor que los marcadores RAPD-PCR analizados.
Aunque la mayoría de las cepas depositadas en la CECT estaban bien identificadas, llevamos a cabo una corrección de datos en 16 de ellas. Estas modificaciones aparecen recogidas en la Tabla 4.
OBJETIVO 3: Escrutinio de la producción de distintas actividades enzimáticas de relevancia agroalimentaria en el listado de hongos filamentosos definido en el objetivo 1.
Dentro del grupo de hongos filamentosos pertenecientes a los géneros Aspergillus y Paecilomyces se realizó un escrutino de 11 actividades enzimáticas de gran relevancia agroalimentaria (ver tablas 5 y 6). Previamente se realizó un primer escrutinio, donde todas las cepas objeto de estudio se sometieron a un test de crecimiento en 4 medios de cultivo distintos (MEA, Czapeck, Cz-Vg y Cz-Carne). La capacidad de crecimiento se analizó a distintas temperaturas (4ºC, 12ºC, 21ºC, 37ºC y 50ºC) y se midió en forma de diámetro de halo de crecimiento por inóculo en punto central.
Dentro del grupo de hongos pertenecientes al género Trichoderma, se analizaron 37 alelos en cinco actividades isoenzimáticas producidas por 18 cepas representativas de 7 especies de Trichoderma. Este estudio permitió correlacionar los marcadores seleccionados para el Objetivo 1 con el establecimiento de tres grupos enzimáticos principales. También se estudió el efecto antimicrobiano en 24 cepas características de la colección de Trichoderma spp. y se midió la actividad antibiótica total junto a las actividades antibacteriana, antilevadura y antihongo filamentoso. Por otro lado, se han caracterizado los genes de 11 nuevas peptidasas de T. harzianum y se comprobó que las peptidasas de las familias M28, M35 y S53 no habían sido descritas con anterioridad en el género Trichoderma.
RESULTADOS
En las tablas 5 y 6 se muestran los resultados obtenidos del ensayo de las diferentes actividades enzimáticas a las temperaturas de 12ºC, 25ºC y 37ºC, para las especies pertenecientes a los géneros Aspergillus y Paecilomyces. A las temperaturas de 4ºC y 50ºC no se observó crecimiento de ninguna de las cepas estudiadas.
El escrutinio de la producción de distintas actividades enzimáticas de relevancia agroalimentaria dentro de las especies pertenecientes al género Trichoderma se llevó a cabo por la Universidad de Salamanca. Resultados publicados en Sanz et al. (2004) y Suárez et al. (2007).
- Sanz, L., Montero, M., Grondona, I., Vizcaíno, J.A., Hermosa, R., Llobell, A. and Monte, E. (2004). Cell wall degrading isoenzyme profiles of Trichoderma biocontrol strains have correlation with rDNA taxonomical species. Current Genetics 46: 277-286.
- Suárez, M.B., Vizcaíno, J.A., Llobell, A. and Monte, E. (2007). Characterization of genes encoding novel peptidases in the biocontrol fungus Trichoderma harzianum CECT 2413 using the TrichoEST functional genomics approach. Current Genetics 51: 331-342.
OBJETIVO 4: Búsqueda e identificación molecular de nuevos aislados de los géneros Aspergillus, Paecilomyces y Trichoderma en nichos fríos (ecosistemas fríos y alimentos refrigerados). Detección de actividades enizmáticas de relevancia a bajas temperaturas.
Este objetivo no se ha cumplido. En primer lugar, debido al recorte presupuestario, tan importante para realizar esta tarea. En segundo lugar porque, una vez abordado el trabajo en el tercer año, no se logró obtener los aislamientos adecuados. Posiblemente, la escasez de nutrientes y, en algunos casos, la fuerte colonización por Mucor spp., casi en cultivo puro junto a algunas bacterias edáficas, impidió el desarrollo de otros hongos. En 2007 se realizó una toma de muestras similar con idénticos resultados negativos para nuestros intereses.
No obstante, dado que interesaba explorar las actividades de Trichoderma que se expresan a bajas temperaturas, se creció Trichoderma harzianum T34 (CECT 2413) a 4ºC y se identificó el gen hsp23, que codifica una small heat shock protein de T. virens, y se transformó en T. harzianum T34 para así estudiar el comportamiento del sistema enzimático de esta cepa en condiciones de estrés térmico. La caracterización del gen hsp23 se ha publicado en Montero-Barrientos et al., (2007).
-Montero-Barrientos, M., Cardoza, R.E., Gutiérrez, S., Monte, E. and Hermosa, R. (2007). The heterologous overexpression of hsp23, a small heat-shock protein gene from Trichoderma virens, confers thermotolerance to T. harzianum. Current Genetics 52: 45-53.
CONCLUSIONES
El planteamiento del proyecto ha permitido desarrollar herramientas basadas en técnicas genético-moleculares para la caracterización a nivel de especie de las cepas pertenecientes a los géneros Aspergillus, Paecilomyces y Trichoderma, géneros de gran relevancia para la industria agroalimentaria. Ello supone un avance significativo en la identificación de especies fúngicas y como se ha puesto de manifiesto, un complemento imprescindible para la caracterización basada en propiedades fenotípicas.
Además ha proporcionado información relevante sobre las actividades enzimáticas y antimicrobianas de todas las cepas objeto de estudio y de los genes responsables de las mismas, tal como ha quedado patente en el presente informe. Esto último abre posibilidades hasta ahora desconocidas para numerosas aplicaciones industriales en el campo agroalimentario y farmacéutico.
La CECT, además de contribuir a la caracterización molecular de dos de los géneros, ha aplicado las técnicas de conservación apropiadas para el mantenimiento en condiciones adecuadas a largo plazo de todas las cepas pertenecientes a los tres géneros objeto de estudio, de forma que estén disponibles para su estudio por parte de la comunidad científica y de su posible explotación a escala industrial en el futuro, en el caso de las cepas depositadas en régimen de depósito público. En el caso de las cepas implicadas en patentes, la CECT actúa como Autoridad Internacional de Depósito y está sujeta a la reglamentación recogida en el tratado de Budapest para fines de patentes, según el cual se compromete a conservar las cepas durante un periodo mínimo de 30 años o cinco años después de recibir la última petición de suministro de una cepa, sin que aparezca en el catálogo de la colección. Además, ha incrementado de forma notable sus recursos genéticos microbianos en los grupos taxonómicos mencionados y ha contribuido a preservar la biodiversidad microbiana, como corresponde al papel de una colección de cultivos microbianos.
El detalle de los resultados obtenidos para este proyecto se puede consultar en las tablas 1 a 6
