Universitat de València – Facultat de Ciències
Biològiques
Departament de Genètica
Unitat
d’Investigació de Genètica Bioquímica i Biotecnologia
Àrees de recerca
última
actualització: 6-10-2010
El grup de Genètica Bioquímica i Biotecnologia treballa en el control microbiològic de plagues d’insectes mitjançant l'ús de Bacillus thuringiensis i baculovirus. A continuació s'exposen unes nocions generals sobre el nostre camp de treball, així com les línies concretes d'investigació en les quals treballem.
1) Bacillus thuringiensis I BACULOVIRUS PER AL CONTROL
MICROBIOLÒGIC DE PLAGUES D’INSECTES
Un dels agents més utilitzats en el control microbiològic de
plagues és el bacteri Bacillus
thuringiensis. Durant l’esporulació sintetitza unes proteïnes
especials que s'agrupen formant un cristall paraesporal que pot arribar a, en
algunes soques, la mateixa grandària que l’espora. Quan els insectes ingereixen
el bacteri esporulat, a més de l’espora també ingereixen el cristall. Aquest es
dissol en l'intestí alliberant els seus components proteics (protoxines) que,
normalment, han de ser activats per proteases intestinals a la seva forma final
tòxica. La toxina llavors s'uneix a
receptors de la membrana epitelial de l'intestí i produeix porus en les
cèl·lules i finalment la mort de l'insecte. Aquest enverinament facilita a
l’espora que germini i envaeixi el seu hoste.
Els altres agents, els baculovirus, són virus que infecten invertebrats, principalment insectes de l’ordre Lepidoptera. També coneguts com nucleopolihedrovirus, són patògens obligats que es caracteritzen per les seues nucleocàpsides en forma de vareta, cadascuna d’elles contenint una molècula única circular de DNA de doble cadena. La nucleocàpsida està envoltada per una membrana de lipoproteïnas per formar virions, els quals són ocluïts per una matriu proteica per formar el cos d’oclusió (OB). Cada OB pot contindre dotzenes de virions. La major part dels baculovirus identificats fins ara han sigut aïllats d’uns pocs centenars d’espècies d’insectes, principalment Lepidoptera i Hymenoptera fitòfags, molts dels quals són plagues importants de conreus agrícoles i de boscos. La infecció per baculovirus comença quan l’insecte ingereix l’OB. Aquest es dissol a l’intestí amb la consegüent alliberament dels virions (també coneguts com virus derivats ocluïts, ODV). Els ODV alliberats es fusionen amb la membrana de les cèl·lules epitelials columnars de l’intestí de l’hoste i entren a la cèl·lula. Una vegada dins, les nucleocàpsides són transportades al nucli on té lloc la transcripció i replicació del genoma víric. Es produeix una nova forma del virus (virus de gemació, BV) en aquestes cèl·lules infectades. Aquestes formes s’alliberaran de les cèl·lules per gemació i expandiran la infecció sistèmicament. A l’últim estadi de la infecció l’insecte es desintegra i allibera milions de BV i OB a l’ambient, amb el que comença un nou cicle.
L'atractiu d'utilitzar aquests patògens en la lluita contra els insectes és, d'una banda, la seva especificitat, amb el que es pot atacar a l'insecte plaga sense afectar les poblacions d'insectes útils i, d'altra banda, són totalment innòcues per a organismes distints als insectes, inclòs l'home. Aquestes característiques fan dels insecticides basats en B. thuringiensis i baculovirus un recurs molt benvolgut des del punt de vista de l'agricultura ecològica. De fet, són dels pocs insecticides permesos en aquest tipus d'agricultura. Un altre atractiu que presenta B. thuringiensis és que, degut al fet que la toxina és una proteïna, es poden manipular els gens en el laboratori de manera que la proteïna mutant posseeixi una eficàcia major o fins i tot desenvolupi toxicitat per a controlar noves plagues. No obstant això, pel que es coneix més a aquest bacteri és per la utilitat que té en l'enginyeria genètica quant a que els seus gens es poden integrar en el genoma de plantes, amb el que aquestes produeixen la proteïna insecticida i es converteixen en resistents als insectes que les ataquen.
La recerca de nous
gens de B. thuringiensis que
codifiquen noves proteïnes insecticides permetrà ampliar l'espectre d'acció
dels insecticides basats en B. thuringiensis. Això és de gran interès no només per combatre
plagues que fins el moment no són controlables mitjançant aquest tipus de
insecticides, sinó per obtenir toxines que mantindran la seva efectivitat per
controlar poblacions d'insectes quan aquestes comencin a desenvolupar
resistència a toxines d'aquest bacteri actualment en ús.
El problema de la resistència en insectes és un problema molt greu, que pot deixar obsolet un insecticida en pocs anys. Aquest problema no afecta només els insecticides químics, sinó que també afecta els insecticides microbians. El coneixement dels mecanismes pels quals les toxines de B. thuringiensis o els baculovirus actuen i pels quals un insecte pot esdevenir resistent a elles pot ajudar a dissenyar estratègies per prevenir l'aparició de resistència al màxim. Els resultats d'aquestes investigacions són de gran importància per dissenyar estratègies d'utilització d’insecticides basats en B. thuringiensis per a que les probabilitats d'aparició de resistència es minimitzin i, d'aquesta manera, es pugui perllongar la utilització d'aquest insecticida de tan preuades característiques. Però aquest coneixement és especialment rellevant en el context del disseny de plantes transgèniques resistents a insectes, ja que la correcta elecció dels gens (que codifiquen toxines) a introduir en una mateixa planta dependrà del seu mecanisme d'acció. Una planta que expressi dues toxines que utilitzin el mateix lloc diana per a la seva acció provocarà l'aparició de resistència en els insectes plaga molt més ràpidament que una que expressi dues toxines amb distints llocs diana.
2)
LÍNIES D'INVESTIGACIÓ I OBJECTIUS DEL GRUP
L'objectiu principal del grup consisteix en el control d'insectes plaga mitjançant l'ús d’insecticides microbians basats en el bacteri Bacillus thuringiensis i baculovirus. El grup treballa en tres línies d'investigació, els objectius de les quals es resumeixen a continuació.
1.
Resistència a bioinsecticides
Objectiu general: Estudi del potencial dels insectes per desenvolupar resistència a les toxines de B. thuringiensis, així com de les bases genètiques i bioquímiques de la mateixa. És una línia d'investigació bàsica, encara que amb projecció aplicada. Va ser amb aquesta línia amb la qual els components més antics del grup van començar a treballar amb B. thuringiensis, a finals del 1989.
Un dels objectius perseguits dintre d'aquesta línia és l'estudi del mecanisme d'acció de les toxines de B. thuringiensis per a, d'aquesta manera, poder comprendre els mecanismes de resistència que poden generar els insectes contra aquestes toxines. El coneixement de l'actuació d'aquestes toxines en una plaga particular també ens permet fer prediccions sobre la possible aparició de resistència creuada a altres toxines de B. thuringiensis. Un altre dels objectius és la determinació concreta del mecanisme de resistència present en races d'insectes resistents a formulats de B. thuringiensis.
L'espècie amb la qual més hem treballat, i amb la qual encara
estem treballant, és l’arna de les crucíferes, Plutella xylostella, la qual és l'única espècie de
moment que ha desenvolupat resistència a B.
thuringiensis en camp (encara que no a conreus transgènics). No
obstant això, el nostre interès abasta qualsevol espècie que hagi desenvolupat
resistència a les toxines de B.
thuringiensis. Hem treballat amb races resistents de laboratori
dels lepidòpters Plodia intercpuntella,
Trichoplusia ni, Ostrinia nubilalis (barrinador del blat de moro) i
Heliothis virescens, i hem
realitzat estudis del mecanisme d'acció en altres lepidòpters, com ara Helicoverpa armigera (heliotis), Phthorimaea operculella (arna de la
patata), Mamestra brassicae, Spodoptera
exigua i Cacyreus marshalli
(barrinador del gerani). També hem treballat amb el dípter Bactrocera oleae (mosca de
l'olivera).
2.
Desenvolupament de nous bioinsecticides
Objectiu general: Trobar soques i gens de B. thuringiensis amb noves capacitats insecticides. Aquesta és un vessant aplicat del grup, ja que la finalitat última és la d'obtenir resultats transferibles a la indústria. Aquesta línia d'investigació va ser iniciada al 1994.
Un dels objectius és el desenvolupament de bioinsecticides basats en noves soques de B. thuringiensis amb alta efectivitat contra insectes plaga. Pretenem utilitzar soques naturals amb alta efectivitat o major espectre d'acció, així com soques híbrides obtingudes mitjançant transferència de plasmidis. Actualment posseïm una col·lecció d'uns 650 aïllats de B. thuringiensis. Un altre objectiu és l'aïllament i caracterització de nous gens d'aquest bacteri que codifiquin proteïnes amb alta acció insecticida.
En col·laboració amb el Departamento de Producción Agraria de la Universidad Pública de Navarra, hem descobert i caracteritzat 5 nous serovars de B. thuringiensis, i hem dipositat les soques tipus en el International Entomopathogenic Bacillus Center de l'Institut Pasteur de París. Fruit també d'aquesta col·laboració ha estat la sol·licitud de dues patents amb dos dels aïllats per la seva alta toxicitat contra lepidòpters. Dues formulacions insecticides basades en aquests aïllats estan en tràmit per a obtenir el registre per a la seva comercialització.
Dintre d'aquesta línia d'investigació col·laborem amb
nombroses empreses, de dintre i fora d'Espanya. Entre els serveis que oferim
podem ressaltar el control de qualitat dels productes basats en B. thuringiensis, així com la
realització d'estudis encaminats a l'obtenció del registre d’aquests tipus de
productes.
3.
Interacció insecte-patògen
Els insectes representen un dels exemples amb més èxit
d’adaptació evolutiva i han sigut capaços de colonitzar gairebé tots els
nínxols ecològics. Per tant, van tindre que veure’s amb una varietat
extremadament gran de patògens, incluïts els baculovirus i B. thuringiensis. L’evolució dels insectes i l’evolució dels seus
patògens han seguit camins paral·lels. Els canvis en el insecte que van
contribuir a reduir l’efecte del patògen han sigut contestats per adaptacions del
patògen intentant escapar de la defensa de l’insecte. A fi de vèncer, o si més
no de minimitzar, l’efecte patològic, els insectes han desenvolupat diferents
mecanismes. Entre els coneguts, alguns d’ells promouen l’activació de
mecanismes de desintoxicació i de reparació de dany. Altres mecanismes inclouen
la síntesi i secreció de pèptids antimicrobians i d’enzims de degradació, la
fagocitosi, melanització, apoptosi cel·lular, o alliberament de les cèl·lules,
entre altres (alguns d’ells probablement encara desconeguts). L’activació
d’aquests mecanismes redueix les possibilitats que els patògens extenguen la
seua infecció i poden ser responsables del desenvolupament de resistència per
part de l’insecte.
Mitjançant la combinació d’SSH (Suppressive Subtractive Hybridization) amb microarrays de DNA estem intentant identificar els elements de l’insecte implicats en la resposta a aquests patògens i, com a conseqüència, que determinen el mecanisme de resposta de l’insecte als patògens. La informació sobre el mecanisme de defensa de l’insecte pot ser de molta utilitat per a la identificació de possibles mecanismes de resistència de l’insecte a baculovirus o a B. thuringiensis. A més a més, la informació obtinguda pot ser utilitzada per optimitzar l’ús d’aquests patògens com a agents de control de plagues. En colaboració amb el grup del Dr. Ruud de Maagd (Plant Research International, Holanda) estem actualment analitzant la interacció entre S. exigua i B. thuringiensis (o les seues toxines). De manera similar, en colaboración amb el Dr. Karl Gordon (CSIRO Entomology, Austràlia) estem analitzant la resposta d’H. armigera al seu baculovirus (HaSNPV) i també a les toxines de B. thuringiensis.
3) FONTS DE FINANÇAMENT I PROJECTES
DE RECERCA:
Els projectes en els que treballem han sigut finançats per la Unió Europea
en tots els Programes Marc des del 3r. També s’ha rebut finançament continuada
per part del Ministeri d’Educació i Ciència (o del de Ciència i Tecnologia) i
de la Generalitat Valenciana concursant amb projectes competitius. Els
projectes més rellevants dels últims 10 anys es mostren a continuació:
Títul del projecte: Introducción de resistencia a Cacyreus
marshalli en Pelargonium zonale
mediante transformación genética con Bacillus
thuringiensis
Entitat
finançadora: Ministerio de Educación y Ciencia
(Proyectos de I+D del programa FEDER) (FD1997-0917-C02-01).
Entitats
participants: Universitat de València, Universidad Politécnica de Valencia i
Fundación PROMIVA (Manises, Valencia)
Títul
del projecte: Manejo de la resistencia a Bacillus thuringiensis en plagas del
algodón.
Entitat
finançadora: Ministerio de Educación y Cultura
(Plan Nacional de I+D, Programa Nacional de Recursos y Tecnología
Agroalimentarias) (AGL2000-0840-C03-01).
Entitats
participants: Universitat de València, Universidad de Córdoba i Universidad
Pública de Navarra.
Títul
del projecte: Obtención de geranios transgénicos resistentes a hongos e insectos
Entitat
finançadora: Ministerio de Ciencia y Tecnología (Plan Nacional I+D+T, Programa
de Fomento de la Investigación Técnica, PROFIT) (FIT-010000-2001-87).
Entitats
participants: Fundación PROMIVA (Majadahonda, Madrid), Instituto de Biología
Molecular (CSIC, Barcelona) i Universitat de València.
Títul
del projecte: Obtención de Pelargonium ornamentales transgénicos resistentes a infección por
hongos patógenos o al ataque por insectos
Entitat
finançadora: Ministerio de Ciencia y Tecnología (Plan Nacional I+D+T, Programa
de Fomento de la Investigación Técnica, PROFIT) (FIT-010000-2002-13).
Entitats
participants: Fundación PROMIVA (Majadahonda, Madrid), Instituto de Biología
Molecular (CSIC, Barcelona) i Universitat de València.
Títul del projecte: Protecting the
benefits of Bt-toxins from insect resistance development by monitoring and
management.
Entitat finançadora: Comisión
Europea (Programa Quality of life and management of living resources).
(QLTR-2001-01969)
Entitats participants: Aachen
University of Technology (Aachen, Alemania), CIB-CSIC (Madrid), INRA La Minière
(Guillantcourt, Francia), Università degli Studi (Milán, Italia), Slovak Agricultural
Unviersity (Nitra, Slovakia), Aristotle University of Thessaloniki (Salónica,
Grecia), Fraunhofer Institute for Molecular BIology and Applied Ecology
(Schmallenberg, Alemania), University of Melbourne (Parkville, Australia) i
Universitat de València.
Títul del projecte: Microbial
alternatives to agrochemicals in plant protection.
Entitat finançadora: Oficina de
Ciencia y Tecnología de la Generalitat Valenciana (OCYTGV). (CTGA/2002/03/01)
Entitats
participants: Universitat de València.
Títul
del projecte: Análisis bioquímico y genético de la resistencia de Plutella xylostella a
las toxinas de Bacillus thuringiensis.
Entitat
finançadora: Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de Méjico (CONACYT) (Ref.
38040-N).
Entitats
participants: Universidad Autónoma de Nuevo León (Méjico) i Universitat de
València.
Títul
del projecte: Desarrollo de un producto bioinsecticida partiendo de una
novedosa cepa de Bacillus thuringiensis autóctona.
Entitat
finançadora: Ministerio de Ciencia y Tecnología (Proyecto de Estímulo a la
Transferencia de Resultados de Investigación, PETRI) (PTR1995-0633-OP).
Entitats participants: Universitat de
València i Industrias AFRASA, S.A.
Títul
del projecte: Bases de
la resistencia a las toxinas de Bt en lepidópteros plaga.
Entitat
finançadora: Ministerio de Ciencia y Tecnología
(Plan Nacional de I+D+I, Programa Nacional de Recursos y Tecnología
Agroalimentarias) (AGL2003-09282-C03-01).
Entitats
participants: Universitat de València, Universidad de Córdoba i Universidad
Pública de Navarra.
Títul
del projecte: Ayudas para grupos de investigación.
Entitat
finançadora: Conselleria de Cultura, Educació i Esport de la Generalitat
Valenciana (GRUPOS2004-21).
Entitats
participants: Universitat de València.
Títul
del projecte: Bases de la resistencia a proteínas cristalinas insecticidas de Bacillus thuringiensis en poblaciones de
lepidópteros.
Entitat
finançadora: Conselleria de Cultura, Educació i Esport de la Generalitat
Valenciana (GV04B-165).
Entitats participants: Universitat de
València.
Títul
del projecte: Prevención de la resistencia a
baculovirus en Spodoptera exigua.
Entitat
finançadora: Ministerio de Educación y Ciencia
(Plan Nacional de I+D+I, Programa Nacional de Recursos y Tecnología
Agroalimentarias) (AGL2005-0709-C03-03/AGR).
Entitats
participants: Universitat de València i Universidad Pública de Navarra
(Pamplona)
Títul
del projecte: Bases de la resistencia a toxinas
de Bacillus thuringiensis en
lepidópteros plaga.
Entitat
finançadora: Conselleria de Empresa, Universidad y Ciencia de la Generalitat
Valenciana, programa de Ayudas complementarias
para proyectos de I+D+I (ACOMP06/133).
Entidades
participantes: Universitat de València, Universidad de Córdoba i Universidad
Pública de Navarra (Pamplona).
Títul
del projecte: Manejo de la resistencia a
proteínas insecticidas de Bacillus thuringiensis.
Entitat
finançadora: Ministerio de Educación y Ciencia
(Plan Nacional de I+D+I, Programa Nacional de Recursos y Tecnología Agroalimentarias)
(AGL2006-11914).
Entitats participants: Universitat de
València.
Títul
del projecte: Constitución de una red de grupos
y centros de investigación para atender la demanda científico-tecnológica de
las empresas de la Comunitat Valenciana (Red Valenciana de Investigación
Vinculada).
Entitat
finançadora: Conselleria de Empresa, Universidad y Ciencia de la Generalitat
Valenciana (ref. ARVIV/2007/090).
Entitats
participants: Universitat de València i altres universitats i centres de
recerca de la Comunidad Valenciana.
Títul del projecte: Host response to baculovirus infection in Helicoverpa
armigera.
Entitat
finançadora: Unión Europea (programa Structuring
the ERA).
Entitats
participants:
Universitat de València
Títul
del projecte: Establecimiento de lazos de colaboración en la investigación
sobre bioinsecticidas basados en Bacillus thuringiensis.
Entitat
finançadora: Programa de Cooperación
Interuniversitaria de la Agencia Española de Cooperación Internacional (AECI)
el marco del PCI-Mediterráneo 2007.
Entitats participants: Universitat de
València i Centre de Biotechnologie de Sfax (Tunísia)
Títul del projecte:.
Specific binding of Bt toxins to midgut membranes from
sweetpotato weevil, Cylas spp.
Entitat finançadora: The Rockefeller
Foundation (07-ENT-367314-VAL).
Entitats participants: Universitat de
València, Auburn University (USA) i Centro Internacional de la Papa (Perú).
Títul del projecte: Mode of action
of Bacillus thuringiensis VIP
proteins in Helicoverpa armigera and
Spodoptera exigua.
Entitat finançadora: Unión
Europea (programa Structuring the ERA).
Entitats participants:
Universitat de València
Títul
del projecte: Genes de respuesta al baculovirus de Spodoptera exigua,
aplicaciones para la mejora de sus propiedades insecticidas.
Entitat
finançadora: Ministerio de Ciencia e Innovación (Plan Nacional de Investigación
Científica y Desarrollo e Innovación Tecnológica) (AGL2008-05456-C03-03).
Entitats participants: Universitat de València y Universidad Pública de Navarra.
Títul
del projecte: Desarrollo de un nuevo
bioinsecticida basado en Pseudomonas fluorescens.
Entitat
finançadora: Conselleria de Empresa, Universidad y Ciencia de la Generalitat
Valenciana (ref. GVPRE/2008).
Entitats
participants: Universitat de València.
Títul del projecte: Toxinas secretables de Bacillus thuringiensis para el control de lepidópteros
Entitat finançadora: Programa de Cooperación Interuniversitaria de la Agencia Española de Cooperación Internacional para el Desarrollo (AECID) en el marco del PCI-Mediterráneo 2008 (A/017413/08).
Entitats participants: Universitat de
València y Centre de Biotechnologie de Sfax (Tunísia).
Títul del projecte: Proteínas insecticidas
de Bacillus thuringiensis de segunda
generación.
Entitat finançadora: Ministerio de Ciencia
e Innovación, Programa Hispano-Brasileño de Cooperación Interuniversitaria
(PHB2008-0113-PC).
Entitats participants: Universitat de
València y Universidade Estadual Paulista (Brasil).
Títul del projecte: Resistance to
African sweetpotato weevils using biotechnology.
Entitat finançadora: The Rockefeller
Foundation (08-EPP-368722-UV).
Entitats participants: Universitat
de València, Auburn University (
Títul del projecte: Manejo
de la resistencia a proteínas insecticidas de Bacillus thuringiensis.
Entitat finançadora: Conselleria d’Educació
de la Generalitat Valenciana, programa de Ayudas complementarias de
I+D+i a grupos de calidad
contrastada para completar el desarrollo de proyectos de I+D vigentes (ref.
ACOMP/2009/313).
Entitats participants: Universitat de València.
Títul del projecte: Modo de acción de proteínas
insecticidas secretables de Bacillus thuringiensis.
Entitat finançadora: Ministerio de Ciencia e
Innovación (Plan Nacional de I+D+I, Programa Nacional de Investigación Fundamental)
(AGL2009-13340-C02-01).
Entitats participants: Universitat de València y
Universidad Pública de Navarra.
Títul del projecte: Manejo de la resistencia a
proteínas insecticidas de Bacillus thuringiensis
Entitat finançadora: Conselleria d’Educació de la
Generalitat Valenciana, programa de Ayudas para grupos de calidad contrastada,
del programa Gerónimo Forteza. (ref. FPA/2010/011).
Entitats participants: Universitat de València
Títul del projecte: Sweet Potato
Action for Security and Health in Africa (SASHA)
Entitat finançadora: Bill and
Melinda Gates Foundation (BMGF)
Entitats participants: Universitat de
València, Centro Internacional de la Papa (CIP), consorcio de países africanos