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Técnicas de estudio en enfermedades ampollosas

Inmunoblot: El Inmunoblot o Western blot es una técnica mediante la cual se separan proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida y después se transfieren electroforéticamente a un papel de nitrocelulosa o una membrana similar, donde son detectadas con anticuerpos que reconocen los antígenos que hay en ellas. Consta de tres fases En la primera fase se separan las proteínas(estractos dérmicos o epidermicos) mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, de esta manera los antígenos proteicos que se quieren utilizar para detectar los anticuerpos son separados electroforéticamente en un gel según su peso molecular. En una segunda fase - denominada immunobloting o immunotransferencia- se transfieren las proteínas que han quedado separadas en el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa mediante una nueva técnica de electroforesis. En la tercera y última fase se utiliza el papel de nitrocelulosa para identificar los anticuerpos dirigidos contra las proteínas transferidas. El papel se corta a tiras y se incuba con los sueros en estudio, posteriormente se incuban las tiras con un reactivo o anticuerpo secundario que permitirá detectar los anticuerpos que se han unido a las proteínas presentes en las tiras. El inmunoblot se utiliza en dermatología para establecer el diagnóstico de las enfermedades ampollosas autoinmunes.

Inmunoprecipitación: La inmuno precipitación es un técnica muy precisa que tiene la ventaja sobre el inmunoblot que no desnaturaliza las proteínas antes de que se produzca la unión del antígeno con el autoanticuerpo, y permite así detectar autoanticuerpos dirigidos contra epítopos conformacionales. Esta técnica se puede dividir en 5 etapas principales: a) radiomarcaje de una proteína celular, b) extracción de la proteína del tejido; c) incubación de la proteína radiomarcada con los autoanticuerpos del paciente (suero en estudio) d) precipitación del complejo antígeno- anticuerpo (inmunoprecipitación) con la ayuda de proteína A o G y e) análisis de las proteínas precipitadas mediante gel de poliacrilamida y autoradiografía. Esta técnica suele emplearse para el diagnóstico de algunas enfermedades ampollosas, para detectar autoanticuerpos dirigidos contra proteínas epidérmicas en el pénfigo vulgar, foliáceo y pénfigo paraneoplásico.

Elisa: La técnica de Elisa (que proviene de la abreviación del ingles enzyme-linked immunosorbent assay). Básicamente consiste en "emparedar"la molécula que haya de analizarse entre otras dos macromoléculas, una de las cuales se halla conjugada a una enzima, lo cual permite su detección mediante un cromógeno o sustancia luminiscente. La técnica de ELISA es sensible, rápida y permite analizar muchas muestras de suero al mismo tiempo ya que no utiliza radioactividad. En el caso de la detección de anticuerpos en suero suele emplearse la técnica de Elisa indirecto. Esta técnica consiste en inmovilizar primero una proteína (el antígeno contra el cual vayan dirigidos los autoanticuerpos que queremos detectar) en una fase sólida (existen placas con múltiples pocillos con los antígenos ya incorporados), tras su preparación y lavado se incuban con los sueros a estudio en diferentes concentraciones y tras los siguientes lavados se incuba con el segundo anticuerpo (anticuerpo antinmunoglubulina humana unida a una enzima (fosfatasa alcalina o peroxidasa)) y posteriormente se realiza el revelado mediante la adición de la sustancia cromógena que reacciona con la enzima permitiendo su medicacion mediante un espectrofotómetro o espectrofluorómetro. En la actualidad se utiliza la técnica de ELISA para el estudio de enfermedades autoinmunes. En las enfermedades ampollosas se han desarrollado test elisa para antigenos como la desmogleina 1 y 3.
Microscopia electrónica y inmunoelectromicroscopia La microscopia electronica se puede utilizar en el estudio de las enfermedades ampollosas autoinmunes paraobservar la morfología de las ampollas, la inmunoelectromicroscopia se puede utilizar para localizar ultraestructuralmente los antigenos involucrados en el desarrollo de las enfermedades.
Ultraestructura de la unión intercelular . Los queratinocios se unen entre ellos por los demosomas (DM), en los cuales se insertan los tonofilamentos. N: nucleo de los queratinocios, PM: membrana plasmática, M:mitocondria	Ultraestructura de la unión dermo-epidérmica. Se observan los hemidesmosomas (HD) en la membrana plasmática de los queratinocitos basales que están unidos a la lámina densa (LD) por medio de los filamentos de anclaje (Af) via lámina lúcida (LL). La lámina densa se une a las fibras de colágena dérmicas por medio de las fibras de anclaje (AF) que forman un asa con ambos extremos en la lámina densa.
Pénfigo vulgar. Piel perilesional, se observa ensanchamieno del espacio intercelular y disminución del número de desmosomas	Penfigoide ampolloso. A pequeño aumento (a) y gran aumento (b y c )Se observa la separación dermoepidérmica a nivel de la lámina lúcida (*), Se observa la lámina densa (flechas) que permanece en el suelo de la ampolla. (E:epidermis, D:dermis)
Inmunoelectromicroscopia con partículas de oro en pacientes con pénfigo vulgar (a) y pénfigo foliáceo (b y c), mostrando la unión de partículas a nivel de los desmosomas, en su mayoría en el espacio extracelular	Antígenos del penfigoide ampolloso. (a) IgG contra el Antégeno del penfigoide ampolloso (BP230) se une contra la porción intracelular de los hemidesmosomas. (b)IgG contra el antígeno 2 del penfigoide (BP180) se une a lo largo de la membrana plasmática de los hemidesmosomas. Los anticuerpos policlonales contra el ext4remoc-terminal del BP2 se unen a lo largo de la lámina densa (c).

Técnicas de estudio en enfermedades ampollosas

Inmunoblot: El Inmunoblot o Western blot es una técnica mediante la cual se separan proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida y después se transfieren electroforéticamente a un papel de nitrocelulosa o una membrana similar, donde son detectadas con anticuerpos que reconocen los antígenos que hay en ellas. Consta de tres fases En la primera fase se separan las proteínas(estractos dérmicos o epidermicos) mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, de esta manera los antígenos proteicos que se quieren utilizar para detectar los anticuerpos son separados electroforéticamente en un gel según su peso molecular. En una segunda fase - denominada immunobloting o immunotransferencia- se transfieren las proteínas que han quedado separadas en el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa mediante una nueva técnica de electroforesis. En la tercera y última fase se utiliza el papel de nitrocelulosa para identificar los anticuerpos dirigidos contra las proteínas transferidas. El papel se corta a tiras y se incuba con los sueros en estudio, posteriormente se incuban las tiras con un reactivo o anticuerpo secundario que permitirá detectar los anticuerpos que se han unido a las proteínas presentes en las tiras. El inmunoblot se utiliza en dermatología para establecer el diagnóstico de las enfermedades ampollosas autoinmunes.

Inmunoprecipitación: La inmuno precipitación es un técnica muy precisa que tiene la ventaja sobre el inmunoblot que no desnaturaliza las proteínas antes de que se produzca la unión del antígeno con el autoanticuerpo, y permite así detectar autoanticuerpos dirigidos contra epítopos conformacionales. Esta técnica se puede dividir en 5 etapas principales: a) radiomarcaje de una proteína celular, b) extracción de la proteína del tejido; c) incubación de la proteína radiomarcada con los autoanticuerpos del paciente (suero en estudio) d) precipitación del complejo antígeno- anticuerpo (inmunoprecipitación) con la ayuda de proteína A o G y e) análisis de las proteínas precipitadas mediante gel de poliacrilamida y autoradiografía. Esta técnica suele emplearse para el diagnóstico de algunas enfermedades ampollosas, para detectar autoanticuerpos dirigidos contra proteínas epidérmicas en el pénfigo vulgar, foliáceo y pénfigo paraneoplásico.

Elisa: La técnica de Elisa (que proviene de la abreviación del ingles enzyme-linked immunosorbent assay). Básicamente consiste en "emparedar"la molécula que haya de analizarse entre otras dos macromoléculas, una de las cuales se halla conjugada a una enzima, lo cual permite su detección mediante un cromógeno o sustancia luminiscente. La técnica de ELISA es sensible, rápida y permite analizar muchas muestras de suero al mismo tiempo ya que no utiliza radioactividad. En el caso de la detección de anticuerpos en suero suele emplearse la técnica de Elisa indirecto. Esta técnica consiste en inmovilizar primero una proteína (el antígeno contra el cual vayan dirigidos los autoanticuerpos que queremos detectar) en una fase sólida (existen placas con múltiples pocillos con los antígenos ya incorporados), tras su preparación y lavado se incuban con los sueros a estudio en diferentes concentraciones y tras los siguientes lavados se incuba con el segundo anticuerpo (anticuerpo antinmunoglubulina humana unida a una enzima (fosfatasa alcalina o peroxidasa)) y posteriormente se realiza el revelado mediante la adición de la sustancia cromógena que reacciona con la enzima permitiendo su medicacion mediante un espectrofotómetro o espectrofluorómetro. En la actualidad se utiliza la técnica de ELISA para el estudio de enfermedades autoinmunes. En las enfermedades ampollosas se han desarrollado test elisa para antigenos como la desmogleina 1 y 3.

Microscopia electrónica y inmunoelectromicroscopia

La microscopia electronica se puede utilizar en el estudio de las enfermedades ampollosas autoinmunes paraobservar la morfología de las ampollas, la inmunoelectromicroscopia se puede utilizar para localizar ultraestructuralmente los antigenos involucrados en el desarrollo de las enfermedades.

Ishiko A. Electron mycroscopy in diagnosis of autoimmune bullous disordes. Clinics in Dermatol 2001, 19:631

Ultraestructura de la unión intercelular . Los queratinocios se unen entre ellos por los demosomas (DM), en los cuales se insertan los tonofilamentos. N: nucleo de los queratinocios, PM: membrana plasmática, M:mitocondria

Ultraestructura de la unión dermo-epidérmica. Se observan los hemidesmosomas (HD) en la membrana plasmática de los queratinocitos basales que están unidos a la lámina densa (LD) por medio de los filamentos de anclaje (Af) via lámina lúcida (LL). La lámina densa se une a las fibras de colágena dérmicas por medio de las fibras de anclaje (AF) que forman un asa con ambos extremos en la lámina densa.

Pénfigo vulgar. Piel perilesional, se observa ensanchamieno del espacio intercelular y disminución del número de desmosomas

Penfigoide ampolloso. A pequeño aumento (a) y gran aumento (b y c )Se observa la separación dermoepidérmica a nivel de la lámina lúcida (*), Se observa la lámina densa (flechas) que permanece en el suelo de la ampolla. (E:epidermis, D:dermis)

Inmunoelectromicroscopia con partículas de oro en pacientes con pénfigo vulgar (a) y pénfigo foliáceo (b y c), mostrando la unión de partículas a nivel de los desmosomas, en su mayoría en el espacio extracelular

Antígenos del penfigoide ampolloso. (a) IgG contra el Antégeno del penfigoide ampolloso (BP230) se une contra la porción intracelular de los hemidesmosomas. (b)IgG contra el antígeno 2 del penfigoide (BP180) se une a lo largo de la membrana plasmática de los hemidesmosomas. Los anticuerpos policlonales contra el ext4remoc-terminal del BP2 se unen a lo largo de la lámina densa (c).