Microarrays
5/16/23
Microarrays
DNA Microarrays
Un ejemplo
Affymetrix Genechip
- ¿Qué tipo de objeto tenemos? ¿Cuál es su clase?
- ¿Qué anotación tiene?
- ¿Cuántas sondas y muestras?
La primera muestra
gse21779_1
AffyID
[1] "1007_s_at" "1007_s_at" "1007_s_at" "1007_s_at" "1007_s_at" "1007_s_at"[1] "1552281_at"[1] 11- ¿Qué tamaños tienen los grupos de sondas?
Variabilidad intra y entre arrays
PM y MM: código
[1] 1088751 883561 1054203 366753 178855 68793 490689 62456 1123802
[10] 939573 1349651 1089915 884725 1055367 367917 180019 69957 491853
[19] 63620 1124966 940737 1350815 [1] 1088751 883561 1054203 366753 178855 68793 490689 62456 1123802
[10] 939573 1349651 [1] 1089915 884725 1055367 367917 180019 69957 491853 63620 1124966
[10] 940737 1350815PM y MM: sondas
Intra
Entre
Comparando PM y MM
Control de calidad
MA plot
Estimadores de densidad
Diagramas de cajas
MAS5
¿Qué tenemos?
- En cada localización tendremos sondas que son oligonucleótidos específicos de un gen.
- De hecho son pares de sonda: una con la secuencia deseada y otra en la que se modifica la base en la posicion 13.
- La intensidad (o expresión) observada con el oligonucleótido correcto le llamamos PM (perfect matching).
- La expresión observado sobre el modificado le llamamos MM (miss matching).
- Una cierta proporción de localizaciones muestran un valor MM mayor que el valor PM.
- http://media.affymetrix.com/support/technical/whitepapers/sadd_whitepaper.pdf
Corrección de fondo
- Se divide el array en K zonas rectangulares: \(Z_k\) con \(k=1,\ldots,K\).
- En cada \(Z_k\) se ordenan las intensidades observadas en las distintas celdas y se considera el 2% con intensidades menores.
- Calculamos su media y desviación estándar muestrales: \(b(Z_k)\) y \(s(Z_k)\).
- Sea la celda localizada en \((x,y)\).
- \(d_k(x,y)\)= la distancia desde \((x,y)\) al centro de la región \(Z_k\).
- Consideramos la siguiente cantidad \[ w_k(x,y) = \frac{1}{d^2_k(x,y) + s_0} \] donde \(s_0\) nos evita que el cociente se pueda anular y por defecto \(s_0 = 100\).
- Para la celda localizada en \((x,y)\) consideramos \[ b(x,y) = \frac{1}{\sum_{k=1}^K w_k(x,y)} \sum_{k=1}^K w_k(x,y) b(Z_k) \]
Ruido local
- Vamos a restar a las intensidades una medida de ruido de fondo local.
- El problema es que nos encontremos con valores negativos.
- Este valor de ruido en la celda localizada en \((x,y)\) se calcula como \[ n(x,y) = \frac{1}{\sum_{k=1}^K w_k(x,y)} \sum_{k=1}^K w_k(x,y) s(Z_k). \]
- La idea ahora es quitar a las intensidades originales el fondo (\(b(x,y)\)) que hemos calculado pero asegurándonos que no nos surja valores negativos.
- La intensidad original se denota como \(I(x,y)\) en la localización \((x,y)\). El valor ajustado de la intensidad viene dado por \[ A(x,y) = \max\{I(x,y) - b(x,y), f_0 n(x,y) \} \]
- El parámetro \(f_0\) se suele fijar en \(f_0 =0.5\).
Cálculo del valor de expresión
- Por el procemiento descrito anteriormente podemos ajustar los valores de PM y de MM.
- En lo que sigue se supone que hemos ajustado estos valores.
- Lo esperable y correcto es que en una celda tengamos un valor de PM mayor que el correspondiente valor MM.
- Esto no es así en muchas ocasiones.
- Se define un valor IM (Ideal Mismatch).
Ideal Mismatch
- Denotamos: \((PM_{ij},MM_{ij})\) el valor de PM y de MM de la j-ésima sonda perteneciente al i-ésimo conjunto de sondas.
- Se calcula un valor que llaman background específico para cada conjunto de sondas. \[ B_i = T_{bi} \{\log_2(PM_{ij}) - \log_2(MM_{ij}): j= 1, \ldots,n_i \}, \] donde \(T_{bi}\) denota el algoritmo bipesado en un solo paso.
- Si el valor de \[ IM_{ij} = \left\{ \begin{array}{cc} MM_{ij} & \mbox{si $MM_{ij}< PM_{ij}$} \\ \frac{PM_{ij}}{2^{ B_i}} &\mbox{si $MM_{ij} \geq PM_{ij}$ y $ B_i > \alpha $} \\ \frac{PM_{ij}}{2^{\frac{\alpha}{1 + (\alpha - B_i)/\beta}}} & \mbox{si $MM_{ij} \geq PM_{ij}$ y $ B_i \leq \alpha $} \end{array} \right. \]
- Por defecto: \(\alpha = 0.03\) y \(\beta = 10\).
Valor resumen
- Calculamos \[ V_{ij} = \max\{PM_{ij} - IM_{ij},d\} \] siendo por defecto \(d = 2^{-20}\).
- Transformamos \[ {\mathbb V}_{ij} = \log_2 (V_{ij}) \] con \(j = 1, \ldots, n_i\).
- Y volvemos a aplicar un estimador biponderado en un solo paso. \[ SignalLogValue_i = T_{bi}({\mathbb V}_{i1}, \ldots, {\mathbb V}_{in_i}). \]
- Fijamos una señal objetivo, Sc: por defecto, \(Sc = 500\).
- Se calcula el siguiente factor de escala para el grupo de sondas i. \[ sf_i = \frac{Sc}{MediaAjustada\{2^{SignalLogValue_i},0.02,0.98\}} \]
- MediaAjustada indica la media ajustada (media de los valores quitando una cierta proporción de los más grandes y de los más pequeños) en donde se quita el 2% de los más grandes y el 2% de los más pequeños.
- El valor final para el conjunto de sondas i es \[ ReportedValue(i) = sf_i \times 2^{SignalLogValue_i} \]
- Se incorpora una posibilidad de normalización que no indicamos.
Algoritmo biponderado de Tukey
- Tenemos unos datos \(x_1,\ldots, x_n\).
- Calculamos la mediana \(m_x\) de los datos \(x_1,\ldots, x_n\).
- Determinamos las distancias \(d_i = |x_i - m_x|\).
- Calculamos la mediana \(m_d\) de \(d_i\) con \(i = 1, \ldots, n\) (MAD, median absolute deviation).
- Consideramos \[ u_i = \frac{x_i - m_x}{c m_d + \epsilon}, \] con \(i = 1, \ldots, n\). Los valores por defecto son \(c= 5\) y \(e =0.0001\) (con el valor de e evitamos la división por cero).
Consideremos una función bicuadrada (bisquare) definida como \[ w(u) = \left\{ \begin{array}{cl} (1- u^2)^2 &\mbox{si $|u| \leq 1$} \\ 0 &\mbox{si $|u| >1$} \end{array} \right.\]
Se define el estimador en un solo paso como \[ T_{bi}(x_1,\ldots,x_n) = \frac{\sum_{i=1}^n w(u_i) x_i}{\sum_{i=1}^n w(u_i)}. \]
Si sustituimos el valor \(m_x\) por \(T_b\) podríamos aplicar iterativamente el procedimiento hasta que se estabilice.
Robust Multichip Average (RMA)
RMA
- En este método trabajamos con todos los arrays simultáneamente.
- A diferencia del método anterior donde se procesaba cada array independientemente.
- El procedimiento solamente utiliza los valores PM y no utiliza para nada los valores MM.
Corrección de fondo
El valor observado aleatorio \(S\) sería \[ S = X + Y \] con \(X \sim Exp(\alpha)\) e \(Y \sim N(\mu,\sigma^2)\).
Se tiene \[ E(X | S = s) = a + b \frac{\phi(\frac{a}{b})}{\Phi(\frac{a}{b})} \] siendo \(a = s - \mu - \sigma^2 \alpha\) y \(b= \sigma\) mientras que
\(\phi\) y \(\Phi\) denotan las funciones de densidad y de distribución de una normal estándar (con media 0 y varianza 1).Los parámetros del modelo (\(\alpha, \mu, \sigma^2\)) se estiman mediante un procedimiento no paramétrico.
Normalización de cuantiles
- Tomamos n vectores de longitud N y construimos la matriz \(X\)
\(N \times n\) que los tiene por vectores columna. - Ordenamos cada columna de \(X\) separadamente y tenemos \(X_s\).
- Calculamos la media por filas de la matrix \(X_s\) y creamos \(X'_s\) una matriz con la misma dimensión que \(X\), tal que en la fila j tenemos la media de la fila de \(X_s\) repetida n veces.
- Obtenemos \(X_t\) en donde cada columna de \(X'_s\) recupera el orden original.
Resumen
- En cada array tendremos \(N\) sondas.
- Suponemos que tenemos \(n\) arrays.
- La matriz de expresión a nivel de sonda será: \[ {\mathbf x} = [x_{ij}]_{i=1,\ldots,N; j =1,\ldots,n}\]
- La sonda \(i\)-ésima en el array \(j\)-ésimo tiene una expresión o intensidad \(x_{ij}\).
- Denotamos el grupo \(k\)-ésimo de sondas con \(S_k\).
- \(S_k \subset \{1,\ldots,N\}\)
- \(S_k = \{i_1,\ldots,i_{|S_k|}\}\)
- Denotamos \[{\mathbf y} = [y_{ij}]_{i=1,\ldots,|S_k|,j=1,\ldots,n} = [x_{ij}]_{i \in S_k,j =1,\ldots,n}.\]
Median polish
Consideramos la matriz para cada grupo de sondas. \[ \begin{array}{ccc|c} \delta_{1,1} & \cdots & \delta_{1,n} & a_1 \\ \vdots & \ddots & \vdots & \vdots \\ \delta_{|S_k|,1} & \cdots & \delta_{|S_k|,n} & a_{|S_k|}\\ \hline b_1 & \cdots & b_{n} & m \end{array} \]
Fijamos \(\delta_{ij} = \log_2(y_{ij})\), \(a_i = b_i = 0 \forall i,j\).
Calculamos la mediana para cada fila a lo largo de las columnas ignorando la última columna (separada por la línea).
Restamos a cada elemento de la fila la mediana correspondiente. Esta mediana se suma a la última columna (formada por \(a_1, \ldots, a_{|S_k|},m\).
Calculamos la mediana para cada columna de los valores correspondientes a las distintas filas sin considerar la última fila.
Restamos la mediana calculada en el paso anterior a cada elemento de la columna exceptuando la última fila. A la última fila sumamos las medianas calculadas.
El proceso descrito en los cuatro pasos anteriores continua iterando sucesivamente entre filas y columnas hasta que los cambios que se producen son nulos o muy pequeños.
Estimaciones
Una vez finalizado el proceso iterativo tendremos:
\(\hat{\mu} = m\)
\(\hat{\theta}_j = b_j\)
\(\hat{\alpha}_i = a_i\)
\(\hat{\epsilon}_{ij} = \delta_{ij}\)
¿Y cómo estimamos la expresión de un grupo de sondas en una array? \[ \hat{\mu} + \hat{\theta}_j \]
Y esto lo repetimos para cada grupo de sondas.
affy
MAS5 y RMA
El método MAS5
El método RMA
Densidades: MAS5
Densidades: RMA
Diagramas de cajas: MAS5
Diagramas de cajas: RMA
