Expresión diferencial con datos RNA-seq

Guillermo Ayala Gallego

2025-05-21

Introducción

Paquetes

pacman::p_load(SummarizedExperiment,edgeR,ggplot2)

Data

data(PRJNA297664,package="tamidata")

colData(PRJNA297664)[,"treatment"]

[1] Wild           Wild           SEC66 deletion Wild           SEC66 deletion
[6] SEC66 deletion
Levels: Wild SEC66 deletion

Una muestra por condición

Un test para comparar proporciones

Queremos comparar dos condiciones y disponemos de una muestra en cada una de las condiciones.
En este caso para cada gen tendríamos una tabla \(2\times2\) como

Muestra Gen Resto Total

1 \(y_1\) \(m_1-y_1\) \(m_1\)

2 \(y_2\) \(m_2-y_2\) \(m_2\)

Total \(y_1 + y_2\) \(m_1+m_2 -y_1 - y_2\) \(m_1 + m_2\)

Muestra	Gen	Resto	Total
1	\(y_1\)	\(m_1-y_1\)	\(m_1\)
2	\(y_2\)	\(m_2-y_2\)	\(m_2\)
Total	\(y_1 + y_2\)	\(m_1+m_2 -y_1 - y_2\)	\(m_1 + m_2\)

edgeR::binomTest

Para el gen i-ésimo tendríamos los conteos \(x_{i1}\) e \(x_{i2}\) en las dos muestras siendo \(m_1\) y \(m_2\) los tamaños de las librerías.
Suponemos fijo el número total de muestras para el gen i (\(n_i = x_{i1} + x_{i2}\)) y tamaño total de las dos librerías \(m_1\) y \(m_2\)
Bajo estas dos hipótesis previas vamos a contrastar que \(H_i: p_1 = m_1/(m_1+m_2)\) frente a \(H_i: p_1 \neq m_1/(m_1+m_2)\)
Como ilustración nos fijamos en las muestras 1 y 3.

pvalor13 = edgeR::binomTest(assay(PRJNA297664)[,1], assay(PRJNA297664)[,3])

pacman::p_load(ggplot2)
df = data.frame(pvalor13)
ggplot2::ggplot(df,aes(x=pvalor13)) + geom_density()

pares = rbind(c(1,3),c(1,5),c(1,6),c(2,3),c(2,5),c(2,6),c(4,3),
    c(4,5),c(4,6))
pvalores = apply(pares,1,
                 function(x) binomTest(assay(PRJNA297664)[,x[1]],
                                       assay(PRJNA297664)[,x[2]]))

y = apply(pvalores,1,function(x) c(mean(x),min(x),max(x)))
df = data.frame(t(y))
names(df) = c("mean","min","max")
df=df[sort(df[,"mean"],index.return=TRUE)$ix,] 
df1 = reshape2::melt(df,id="mean") 
pp = ggplot(df1,aes(x=mean,y=value,color=variable))
pp + geom_smooth()

edgeR clásico

Introducción

Para dos grupos.
Es un test exacto.
Propuesto en Robinson and Smyth (2008) y Robinson and Smyth (2007) (en este orden).

Estimación de una dispersión común

Consideramos una característica (gen por ejemplo) en \(n\) muestras (o librerías) de tamaños distintos.
\(m_i\), tamaño de la \(i\)-ésima librería (total de lecturas).
\(\lambda\), la proporción que hay en una librería cualquiera de la característica en que estamos interesados.
Si \(Y \sim NB(\mu,\phi)\) entonces la función de probabilidad viene dada por \[ f(y|\mu,\phi) = P(Y=y|\mu,\phi) = \frac{\Gamma(y+\phi^{-1})}{\Gamma(\phi^{-1}) \Gamma(y+1)} \bigg( \frac{1}{1 + \mu \phi} \bigg)^{\phi^{-1}} \bigg( \frac{\mu}{\phi^{-1} + \mu} \bigg)^{y}. \]
Se tiene:
- \(E(Y) = \mu\),
- \(var(Y) = \mu + \phi \mu^2\).
Asumimos: \(Y_i \sim NB(m_i \lambda, \phi)\).

Si las librerías tienen el mismo tamaño

Si todas las librerías tienen el mismo tamaño: \(m_i = m\) para \(i=1,\ldots,n\) entonces \[Z = \sum_{i=1}^n Y_i \sim NB(nm\lambda,\phi/n).\]
La logverosimilitud condicionada al valor \(Z=z\) no depende de \(\lambda\) y podemos estimar el valor de \(\phi\).
Se estimaría \(\phi\) maximizando la logverosimilitud condicionada (a la suma de todos los conteos del gen) dada por \[\ell_{\mathbf{y} | z} = \bigg [ \sum_{i=1}^n \log \Gamma(y_i + 1/\phi) \bigg ] + \log \Gamma(n/\phi) - \log \Gamma(z + n/\phi) - n \log \Gamma(1/\phi),\] donde \({\mathbf y} =(y_1,\ldots,y_n)'\) son los conteos observados.
En el caso en que los tamaños de las librerías son distintos la verosimilitud no tiene una expresión simple.
Modificamos los \(y_i\) observados generando unos pseudodatos con el mismo tamaño de librería dado por \[m^* = \bigg (\prod_{i=1}^n m_i \bigg )^{\frac{1}{n}}.\]
¿Y cómo transformamos los conteos \(y_i\)?

qCML: Quantile-adjusted condicional maximum likelihood

Inicializamos \(\phi\) (por ejemplo, con el estimador maxímo verosímil condicionado sin realizar ningún ajuste).
Dado el valor estimado de \(\phi\), estimamos \(\lambda\) maximizando la verosimilitud para el valor dado de la dispersión.
Suponemos que cada conteo \(y_i\) es un valor observado de una distribución binomial negativa con media \(m_i \lambda\) y parámetro de dispersión \(\phi\). Calculamos los percentiles \[p_i = P(Y < y_i|m_i \lambda,\phi) + \frac{1}{2} P(Y = y_i|m_i \lambda,\phi),\] para \(i=1,\ldots,n\).
Suponemos ahora una distribución binomial negativa con media \(m^* \lambda\) y dispersion \(\phi\).
1. Determinamos qué valor sería el percentil de orden \(p_i\) en la nueva distribución. Ya no tiene porqué ser un dato entero e incluso puede ser negativo.
2. Los pseudodatos para un mismo gen tienen aproximadamente la misma distribución.
Estimamos la dispersión \(\phi\) con los pseudodatos utilizando la veromilitud condicionada a la (pseudo) suma total de un gen.
Repetimos desde 2 hasta 5 hasta que converja \(\phi\).

Un test exacto para dos grupos

\(y_{ijk}\) el conteo para la muestra \(k\) en la condición \(j\) del gen \(i\) donde \(j=1,2\) y \(k=1,\ldots,n_j\).
Los tamaños de la librería k de la condición j será \(m_{jk}\).
Los tamaños de las librerías no son iguales dentro de cada clase.
Aplicamos el procedimiento qCML dentro de cada clase.
Tenemos un tamaño común \(m_j\) en la condición \(j\).
Estimamos \(\phi\) maximizando \[ l(\phi) = \sum_{i=1}^N \ell_i (\phi). \] con \[\ell_i (\phi) = \sum_{j=1}^2 \bigg ( \sum_{k=1}^{n_j} \log \Gamma(y_{ijk} + \phi^{-1}) + \log \Gamma(n_j \phi^{-1}) - \log \Gamma(z_{ij} + n_j \phi^{-1}) - n_j \log \Gamma(\phi^{-1})\bigg ).\] siendo \(z_{ij}= y_{ij\cdot} = \sum_{k=1}^{n_j} y_{ijk}\).
El estimador de \(\phi\) será \(\hat{\phi}_C\).

Contraste de hipótesis

Asumimos: \(EY_{ijk} = m_{jk} \lambda_{ij}\).
La hipótesis nula, no hay diferencias entre las medias de los conteos en las dos condiciones para el \(i\)-ésimo gen se formularía como

\(H_i: \lambda_{i1} = \lambda_{i2},\) vs \(K_i: \lambda_{i1} \neq \lambda_{i2}\).
- Bajo \(H_i\), \(\lambda_{i1} = \lambda_{i2} = \lambda_i\).
- Aplicamos qCML a todas las muestras: \(y_{ijk}\) son los pseudodatos.
- Utilizando el estimador \(\hat{\phi}_C\) y los conteos \(y_{ijk}\) podemos estimar \(\lambda_i\).
- Bajo la hipótesis nula de no diferencia entre grupos tendríamos que \(Y_{ij\cdot} = \sum_{k=1}^{n_j} Y_{ijk} \sim NB(n_j m^* \hat{\lambda}_i, \hat{\phi}_C/n_j)\).

\(Y_{i1\cdot}\) e \(Y_{i2\cdot}\) son independientes.
La suma \(Y_{i1\cdot} + Y_{i2\cdot}\) también tiene una distribución binomial negativa: \(Y_{i1\cdot} + Y_{i2\cdot} = \sum_{i=1}^2 \sum_{k=1}^{n_j} Y_{ijk} \sim NB((n_1+n_2) m^* \hat{\lambda}_i,\hat{\phi}_C/(n_1+n_2))\)
Podemos considerar la distribución condicionada del vector aleatorio \((Y_{i1\cdot},Y_{i2\cdot})\) a la suma \(Y_{i1\cdot} + Y_{i2\cdot}\) y considerar las probabilidades de los conteos conjuntos que son menos probables que el observado.
La suma de estas probabilidades nos daría el p-valor del test.

Dispersiones posiblemente distintas

Una misma dispersión sobre una cantidad grande de genes no es muy razonable.
Buena desde el punto de vista del modelo y su estimación pero nos aleja de los datos.
Supongamos dispersiones posiblemente distintas para los distintos genes, \(\phi_i\).
Proponen \[WL(\phi_i) = \ell_i(\phi_i) + \alpha \ell(\phi_i)\] siendo \(\alpha\) el peso que se da a la verosimilitud global.
Es una función que propone un compromiso entre considerar \(l\) como función a maximizar considerando la misma contribución a todos los genes y \(l_i\) en donde solamente consideramos los conteos del propio gen.
En Robinson and Smyth (2008) proponen un método de estimación de \(\alpha\).

Un análisis con edgeR

DGEList

Tenemos un SummarizedExperiment.
Construimos un DGEList.

x = DGEList(counts = assay(PRJNA297664),
            group = colData(PRJNA297664)[,"treatment"])

La clase del nuevo objeto es

class(x)

[1] "DGEList"
attr(,"package")
[1] "edgeR"

Y sus atributos son

attributes(x)

$class
[1] "DGEList"
attr(,"package")
[1] "edgeR"

$names
[1] "counts"  "samples"

La matriz de conteos

x$counts

Tenemos la componente samples.

class(x$samples)

[1] "data.frame"

Las primeras filas son

head(x$samples)

                 group lib.size norm.factors
Sample1           Wild  4788536            1
Sample2           Wild  9387986            1
Sample3 SEC66 deletion  9599910            1
Sample4           Wild  8896028            1
Sample5 SEC66 deletion  9003755            1
Sample6 SEC66 deletion  9002105            1

Tenemos un factor.

x$samples[,"group"]

[1] Wild           Wild           SEC66 deletion Wild           SEC66 deletion
[6] SEC66 deletion
Levels: Wild SEC66 deletion

Los tamaños de las librerías son

x$samples[,"lib.size"]

[1] 4788536 9387986 9599910 8896028 9003755 9002105

Los factores de normalización son

x$samples[,"norm.factors"]

[1] 1 1 1 1 1 1

Veamos una descripción de los tamaños de las librerías.

summary(x$samples[,"lib.size"])

   Min. 1st Qu.  Median    Mean 3rd Qu.    Max. 
4788536 8922547 9002930 8446387 9291928 9599910

ggplot(x$samples,aes(x= lib.size)) + geom_dotplot()

Eliminando genes con conteos bajos

Utilizamos los conteos por millón CPM en lugar de los conteos originales. Obligamos a que se recalculen los tamaños de las librerías.

 keep = rowSums(cpm(x)>1) >= 2
 x <- x[keep, , keep.lib.sizes=FALSE]

dge = DGEList(counts=assay(PRJNA297664),
              group=colData(PRJNA297664)[,"treatment"])
dge.c = estimateCommonDisp(dge) ##Estimamos dispersión común
dge.c$common.dispersion

[1] 0.01170892

dge.t =  estimateTagwiseDisp(dge.c) ##Dispersiones por gen
et.c = exactTest(dge.c)
et.t = exactTest(dge.t)

Y vemos los resultados.

topTags(et.c)

Comparison of groups:  SEC66 deletion-Wild 
               logFC   logCPM        PValue           FDR
YBR171W   -10.150220 6.114922 2.128720e-258 1.516926e-254
YCR021C    -1.928779 8.463733  4.873506e-47  1.736430e-43
YBR054W    -1.878579 7.156683  3.518798e-43  8.358318e-40
YGL255W    -1.846348 7.518466  1.930760e-42  3.439650e-39
YNR034W-A  -2.176676 4.670571  1.175800e-40  1.675749e-37
YBR093C    -1.694281 8.563323  2.731791e-37  3.244457e-34
YFR053C     1.621598 6.384697  2.625927e-31  2.673194e-28
YER150W    -1.560027 5.479642  2.325258e-26  2.071224e-23
YDR171W    -1.383170 7.792428  2.142035e-25  1.696015e-22
YDR214W     1.362108 7.982939  1.024220e-24  7.298589e-22

topTags(et.t)

Comparison of groups:  SEC66 deletion-Wild 
               logFC    logCPM        PValue           FDR
YBR171W   -10.150503  6.114922 5.636513e-296 4.016579e-292
YGL255W    -1.846051  7.518466  5.459134e-30  1.945090e-26
YBR093C    -1.694086  8.563323  5.843701e-27  1.388074e-23
YNR034W-A  -2.174452  4.670571  7.411466e-22  1.320353e-18
YDR214W     1.362104  7.982939  2.334672e-20  3.327375e-17
YLR109W     1.240894  9.510958  4.583075e-20  5.443166e-17
YHR215W    -1.208860  9.533270  2.172522e-18  2.211627e-15
YAR071W    -1.211709  9.219219  3.764430e-18  3.353166e-15
YMR186W     1.109256 11.622933  9.483967e-18  7.509195e-15
YKL161C     1.100257  5.723199  1.070358e-16  7.627369e-14

edgeR utilizando modelo lineal generalizado

Modelo

\(Y_{ij}\) el conteo aleatorio (número de lecturas alineadas) para el gen \(i\) en la muestra \(j\).
Denotamos por \(m_j = \sum_{i=1}^N y_{\cdot j}\) la profundidad de secuenciación o total de lecturas de la muestra \(j\).
Utilizamos como función de enlace el logarítmo natural.
Consideramos la profundidad de secuenciación como offset (un modelo de tasas sobre la profundidad de secuenciación).
El modelo para la media es \[ \ln \mu_{ij} = \mathbf x_j^T \mathbf \beta_i + \ln m_j. \]
En el modelo las variables predictoras son comunes a todos los genes.
Asumimos que la componente aleatoria sigue una distribución binomial negativa (con el parámetro de dispersión conocido).
Entonces \[ var(Y_{ij}) = \mu_{ij} + \phi_i \mu_{ij}^2, \] siendo \(\phi_i\) el parámetro de dispersión que hemos de asumir conocido o, de otro modo, tenemos que estimarlo previamente.

En McCarthy, Chen, and Smyth (2012) muestran cómo estimar por máxima verosimitud el vector de coeficientes \(\mathbf \beta_i\).
Utilizan una modificación de los mínimos cuadrados iterativamente reponderados (IRWLS).
El parámetro de dispersión se estima maximizando la logverosimilitud penalizada definida como \[ APL_i(\phi_i) = \ell(\phi_i;\mathbf y_i,\hat{\mathbf \beta}_i) - \frac12 \ln |\mathbb I_i| \] siendo:
- \(\mathbf y_i\) los conteos para el gen \(i\),
- \(\hat{\mathbf \beta}_i\) el vector de coeficientes,
- \(\ell()\) es la función de logverosimilitud
- \(|\mathbb I_i|\) el determinante de la matriz de información de Fisher para el \(i\)-ésimo gen.

TCGA-COAD

pacman::p_load(edgeR,SummarizedExperiment)
load(paste0(dirTamiData,"tcga_coad.rda"))

Nos centramos en las variables fenotípicas age_at_diagnosis y tissue_or_organ_of_origin.

colData(tcga_coad)

DataFrame with 328 rows and 30 columns
                             shortLetterCode          definition sample_type_id
                                    <factor>            <factor>       <factor>
TCGA-AM-5820-01A-01R-1653-07              TP Primary solid Tumor             01
TCGA-D5-6920-01A-11R-1928-07              TP Primary solid Tumor             01
TCGA-DM-A1HB-01A-21R-A180-07              TP Primary solid Tumor             01
TCGA-AA-3518-11A-01R-1672-07              NT Solid Tissue Normal             11
TCGA-F4-6461-01A-11R-1774-07              TP Primary solid Tumor             01
...                                      ...                 ...            ...
TCGA-AA-3511-11A-01R-1839-07              NT Solid Tissue Normal             11
TCGA-AA-3713-11A-01R-1723-07              NT Solid Tissue Normal             11
TCGA-AA-A02K-01A-03R-A32Y-07              TP Primary solid Tumor             01
TCGA-CK-5913-01A-11R-1653-07              TP Primary solid Tumor             01
TCGA-A6-5657-01A-01R-A32Z-07              TP Primary solid Tumor             01
                                     sample_type days_to_diagnosis
                                        <factor>         <numeric>
TCGA-AM-5820-01A-01R-1653-07 Primary Tumor                       0
TCGA-D5-6920-01A-11R-1928-07 Primary Tumor                       0
TCGA-DM-A1HB-01A-21R-A180-07 Primary Tumor                       0
TCGA-AA-3518-11A-01R-1672-07 Solid Tissue Normal                 0
TCGA-F4-6461-01A-11R-1774-07 Primary Tumor                       0
...                                          ...               ...
TCGA-AA-3511-11A-01R-1839-07 Solid Tissue Normal                 0
TCGA-AA-3713-11A-01R-1723-07 Solid Tissue Normal                 0
TCGA-AA-A02K-01A-03R-A32Y-07 Primary Tumor                       0
TCGA-CK-5913-01A-11R-1653-07 Primary Tumor                       0
TCGA-A6-5657-01A-01R-A32Z-07 Primary Tumor                       0
                             tissue_or_organ_of_origin age_at_diagnosis
                                              <factor>        <numeric>
TCGA-AM-5820-01A-01R-1653-07          Colon, NOS                  21902
TCGA-D5-6920-01A-11R-1928-07          Sigmoid colon               28124
TCGA-DM-A1HB-01A-21R-A180-07          Transverse colon            27708
TCGA-AA-3518-11A-01R-1672-07          Cecum                       29769
TCGA-F4-6461-01A-11R-1774-07          Colon, NOS                  15151
...                                                ...              ...
TCGA-AA-3511-11A-01R-1839-07           Colon, NOS                 23407
TCGA-AA-3713-11A-01R-1723-07           Colon, NOS                 24927
TCGA-AA-A02K-01A-03R-A32Y-07           Ascending colon            18506
TCGA-CK-5913-01A-11R-1653-07           Ascending colon            21399
TCGA-A6-5657-01A-01R-A32Z-07           Colon, NOS                 23920
                                   primary_diagnosis prior_malignancy
                                            <factor>         <factor>
TCGA-AM-5820-01A-01R-1653-07 Adenocarcinoma, NOS                   no
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TCGA-F4-6461-01A-11R-1774-07 Adenocarcinoma, NOS                   no
...                                              ...              ...
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TCGA-AA-3511-11A-01R-1839-07             Colon, NOS     
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TCGA-AA-3518-11A-01R-1672-07 Colon Adenocarcinoma       TRUE     TRUE
TCGA-F4-6461-01A-11R-1774-07 Colon Adenocarcinoma       TRUE     TRUE
...                                           ...        ...      ...
TCGA-AA-3511-11A-01R-1839-07 Colon Adenocarcinoma       TRUE     TRUE
TCGA-AA-3713-11A-01R-1723-07 Colon Adenocarcinoma       TRUE     TRUE
TCGA-AA-A02K-01A-03R-A32Y-07 Colon Adenocarcinoma       TRUE     TRUE
TCGA-CK-5913-01A-11R-1653-07 Colon Adenocarcinoma       TRUE     TRUE
TCGA-A6-5657-01A-01R-A32Z-07 Colon Adenocarcinoma       TRUE     TRUE

summary(colData(tcga_coad)[,"age_at_diagnosis"])

   Min. 1st Qu.  Median    Mean 3rd Qu.    Max.    NA's 
  11391   20604   24896   24146   28204   32872       4

table(colData(tcga_coad)[,"tissue_or_organ_of_origin"])


         Ascending colon                    Cecum               Colon, NOS 
                      72                       70                       59 
        Descending colon Hepatic flexure of colon    Rectosigmoid junction 
                      15                       12                        3 
           Sigmoid colon Splenic flexure of colon         Transverse colon 
                      76                        6                       13

Hemos de eliminar aquellas muestras que tienen las variables predictoras con datos faltantes ya que las funciones que siguen no los admiten.

torm1 = which(is.na(colData(tcga_coad)$"age_at_diagnosis"))
torm2 = which(is.na(colData(tcga_coad)$ "tissue_or_organ_of_origin"))
toremove = union(torm1,torm2)
tcga_coad = tcga_coad[,-toremove]

Construimos el objeto DGEList sin indicar ninguna variable group ni ninguna matriz de modelo y eliminamos genes con conteos bajos.

dge = DGEList(counts=assay(tcga_coad))
to_keep = rowSums(cpm(dge) > 0.5) > 20
dge =  dge[to_keep,keep.lib.sizes=FALSE]
dim(dge)

[1] 16155   324

Construimos la matriz de modelo con las dos variables predictoras, una de caracter categórico y la otra numérica.
Cambiamos los nombres de las columnas de la matriz de modelo.

design0 = model.matrix(~  0 +
         colData(tcga_coad)$"tissue_or_organ_of_origin"
       + colData(tcga_coad)$"age_at_diagnosis")
y = levels(colData(tcga_coad)$"tissue_or_organ_of_origin")
y = sapply(y,function(x) gsub(" ","_",x)) ## Eliminamos espacios
y = sapply(y,function(x) gsub(",","_",x)) ## Eliminamos las comas
colnames(design0) = c(y,"age_at_diagnosis")

Estimamos las dispersiones por tres métodos distintos:
- Asumiendo una dispersión común,
- una por gen y
- con una relación media-varianza.

dge = estimateDisp(dge,design=design0)

Si solo queremos una de las tres opciones podemos usar las funciones estimateGLMCommonDisp(), estimateGLMTagwiseDisp() y estimateGLMTrendedDisp().

plotBCV(dge)

fit = glmFit(dge, design=design0)

Veamos si influye la variable age_at_diagnosis.
Si observamos la matriz de modelo design0 corresponde con la columna 10 de la matriz de modelo.
Se realiza un test del cociente de verosimilitudes.

lrt1 = glmLRT(fit,coef="age_at_diagnosis")
lrt1 =  glmLRT(fit,coef=10) ## Equivalente a la línea anterior
topTags(lrt1)

Coefficient:  age_at_diagnosis 
                logFC      logCPM       LR       PValue          FDR
UGT2B10 -0.0002335397  0.07018047 68.64932 1.176251e-16 1.753945e-12
KCNH3   -0.0001438677 -0.73269543 67.44089 2.170993e-16 1.753945e-12
CPS1    -0.0002306034  4.32352487 60.85641 6.139324e-15 3.306640e-11
SULT1E1 -0.0002374397  0.83203192 57.37333 3.604616e-14 1.456085e-10
GPR64   -0.0001654538  0.52261384 55.61329 8.822524e-14 2.851087e-10
UPK1A   -0.0002044708 -0.94768507 53.99073 2.014376e-13 5.424715e-10
KRT81   -0.0001417146 -0.31911518 50.55783 1.157049e-12 2.670799e-09
DLX5    -0.0001507914 -0.47209136 45.87384 1.261190e-11 2.547288e-08
EPHX3   -0.0001195753 -0.07584401 45.21348 1.766851e-11 2.897626e-08
CACNA1I -0.0001300370 -0.65221580 45.18437 1.793308e-11 2.897626e-08

Podemos evaluar toda la variable tissue_or_organ_of_origin.

lrt2 = glmLRT(fit,coef=1:9)
topTags(lrt2)

Coefficient:  Ascending_colon Cecum Colon__NOS Descending_colon Hepatic_flexure_of_colon Rectosigmoid_junction Sigmoid_colon Splenic_flexure_of_colon Transverse_colon 
          logFC.Ascending_colon logFC.Cecum logFC.Colon__NOS
RBM44                 -23.03403   -22.79346        -23.20739
LPAL2                 -22.83425   -22.63042        -22.87998
C6orf52               -22.69677   -22.74012        -22.53655
SLC5A10               -22.59678   -22.67309        -22.35748
APOBEC3H              -22.53489   -22.57474        -22.19753
LINC00574             -22.53141   -22.30988        -21.93773
ATOH7                 -22.50255   -22.51006        -22.89692
GRAPL                 -22.47544   -21.90377        -21.80912
C6orf201              -22.45426   -22.61184        -22.56993
RPL23AP64             -22.43706   -22.48745        -22.71604
          logFC.Descending_colon logFC.Hepatic_flexure_of_colon
RBM44                  -22.81666                      -22.98087
LPAL2                  -22.60164                      -22.63563
C6orf52                -23.72080                      -22.34341
SLC5A10                -22.81269                      -22.55916
APOBEC3H               -22.89885                      -22.24700
LINC00574              -22.53327                      -21.59098
ATOH7                  -22.36426                      -21.88149
GRAPL                  -22.20629                      -22.98721
C6orf201               -22.39796                      -22.18401
RPL23AP64              -22.31727                      -22.72084
          logFC.Rectosigmoid_junction logFC.Sigmoid_colon
RBM44                       -23.39152           -22.83901
LPAL2                       -23.04283           -22.15825
C6orf52                     -22.72652           -22.77770
SLC5A10                     -22.73793           -22.61990
APOBEC3H                    -23.32153           -22.97932
LINC00574                   -22.95598           -22.59596
ATOH7                       -22.15867           -21.84132
GRAPL                       -23.39572           -22.33813
C6orf201                    -23.12831           -22.58081
RPL23AP64                   -22.02019           -22.25008
          logFC.Splenic_flexure_of_colon logFC.Transverse_colon    logCPM
RBM44                          -23.79191              -19.16905 -1.002324
LPAL2                          -21.86348              -22.40498 -1.565987
C6orf52                        -23.11693              -22.67335 -1.343997
SLC5A10                        -22.40977              -22.32619 -1.460341
APOBEC3H                       -23.29649              -22.81347 -1.370931
LINC00574                      -22.88247              -22.21847 -1.774904
ATOH7                          -23.02326              -22.96452 -1.657356
GRAPL                          -22.30881              -21.52397 -1.620106
C6orf201                       -22.25201              -21.85007 -1.707904
RPL23AP64                      -22.98331              -21.64723 -1.707398
                LR PValue FDR
RBM44     3115.908      0   0
LPAL2     1931.307      0   0
C6orf52   1762.968      0   0
SLC5A10   4317.670      0   0
APOBEC3H  1790.031      0   0
LINC00574 1759.550      0   0
ATOH7     2369.495      0   0
GRAPL     1708.911      0   0
C6orf201  2875.556      0   0
RPL23AP64 2940.747      0   0

Y elegir los contraste que queramos.
Mostramos una comparación entre dos grupos.

AD = makeContrasts(contrast1 = Ascending_colon - Descending_colon,
                   levels=design0)
lrt3 = glmLRT(fit,contrast = AD)
topTags(lrt3)

Coefficient:  1*Ascending_colon -1*Descending_colon 
           logFC     logCPM       LR       PValue          FDR
ACTL8  -3.626585  1.9449815 41.05906 1.476981e-10 1.765755e-06
DBH    -2.980882 -0.6717054 40.29327 2.185611e-10 1.765755e-06
IGFN1  -3.772058  0.1735114 38.82410 4.637663e-10 2.497845e-06
PCCA   -1.854167  6.0403726 37.84606 7.655289e-10 3.092354e-06
INHA   -3.544573 -1.2757898 34.69282 3.860522e-09 1.247566e-05
FLT3   -2.515272 -0.6541790 34.27551 4.783649e-09 1.288237e-05
MUM1L1 -2.947467 -0.5294079 29.86079 4.642074e-08 1.071523e-04
MYO3B  -2.250829 -1.0459367 28.57745 9.002435e-08 1.818267e-04
KRT14   8.581216  2.8419848 26.64655 2.442861e-07 4.385750e-04
PPP4R4 -2.363616 -1.4762586 24.69543 6.714311e-07 1.084898e-03

Bibliografía

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Robinson, Mark D., and Gordon K. Smyth. 2007. “Moderated Statistical Tests for Assessing Differences in Tag Abundance.” Bioinformatics 23 (21): 2881–87. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btm453.

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