Líneas de investigación

Relaciones entre las bacterias no cultivadas y sus bacteriófagos

Los descubrimientos de nuevos bacteriófagos en las secuencias metagenómicas se están acelerando a un ritmo sin precedentes (Low et al., 2019). Para comprender plenamente los efectos de los bacteriófagos en los ecosistemas locales y globales, como el control de la dinámica de crecimiento de las poblaciones bacterianas o la reprogramación de la célula bacteriana a través de genes metabólicos auxiliares introducidos por los bacteriófagos, es fundamental establecer vínculos entre los bacteriófagos y las bacterias. En la actualidad, la mayoría de las secuencias de los bacteriófagos no están asociadas a ningún hospedador, y en el caso que un bacteriófago tiene un hospedador conocido, se desconoce el número total de sus hospedadores. Los estudios de las infecciones por los bacteriófagos se limitan a las bacterias cultivables en el laboratorio, pero muchas especies bacterianas no pueden cultivarse. Incluso las bacterias estudiadas intensamente, por ejemplo, las que se encuentran en el intestino humano, suelen carecer de bacteriófagos aislados.

Se han utilizado múltiples métodos computacionales para predecir los vínculos entre los bacteriófagos y sus hospedadores, por ejemplo, buscando CRISPRs o tRNAs en los genomas. Nuestro grupo también está desarrollando un nuevo método computacional para vincular los bacteriófagos con sus hospedadores, y para predecir si los bacteriófagos son líticos (matan a las bacterias tras la infección) o lisogénicos (pasan la mayor parte del tiempo integrados en los genomas del hospedador como profagos).

Aunque los métodos computacionales son potentes, las pautas genómicas para vincular un bacteriófago con una bacteria no siempre están presentes y, además, estos vínculos no proporcionan pruebas de infecciones activas. El método más ventajoso para estudiar las interacciones entre los bacteriófagos y las bacterias es la genómica de células individuales microbianas. Representa una oportunidad única para relacionar los bacteriófagos con sus hospedadores mediante pruebas experimentales, ya que una cierta parte de las células recolectada directamente de un ambiente contienen bacteriófagos en la célula bacteriana o adheridos a ella (Jarett et al., 2020).

Podemos teñir los bacteriófagos y utilizarlos como sondas fluorescentes en los experimentos de citometría de flujo (FACS), si purificamos los bacteriófagos y las bacterias de la misma muestra por separado, o utilizamos bacteriófagos y bacterias de dos muestras diferentes. Después recolectamos las bacterias que hayan adquirido fluorescencia a través de los bacteriófagos fluorescentes mediante FACS. Este método se denomina “single-cell viral tagging” y representa una gran ventaja en comparación con la detección de fagos adjuntos accidentalmente a las células bacterianas en la naturaleza. La fluorescencia emitida por las células bacterianas proporciona evidencia de que los fagos fluorescentes estaban presentes en forma de viriones, lo que nos permite explorar el rango de hospedadores de estos bacteriófagos en una manera más eficiente que el análisis computacional tradicional o la observación de la presencia de los bacteriófagos en las células hospedadoras en su estado natural (Džunková et al., 2019).

EL método “single-cell viral tagging” hemos iniciado en el Australian Centre for Ecogenomics y hemos continuado con ella en el DOE Joint Genome Intitute del Lawrence Berkeley National Laboratory. Aquí en el I2SysBio en Valencia, el tema de los bacteriófagos en las células individuales forma parte de nuestro proyecto de investigación CDEIGENT/2021/008 financiado por el plan GenT de la Generalitat Valenciana.

En nuestro grupo de I2SysBio estamos interesados en explorar las infecciones virales en las células bacterianas de diferentes ecosistemas mediante la genómica de células individuales microbianas. Los bacteriófagos tienen un enorme potencial para influir en la salud humana de forma indirecta, modificando la composición bacteriana del microbioma humano. Por ello, la idea de emplear bacteriófagos en medicina clínica está atrayendo mucha atención científica. Nuestros planes son encontrar una aplicación del “single-cell viral tagging” en biomedicina, por ejemplo, para predecir las interacciones entre los bacteriófagos y las bacterias tras un trasplante de microbiota fecal (FMT), en el que los bacteriófagos de un voluntario sano se aplican a un paciente que sufre una enfermedad gastrointestinal.

El FMT y los fagos individuales se han utilizado para el tratamiento experimental de la infección por Clostridioides difficile, sin embargo, se desconocen en gran medida sus efectos en la comunidad intestinal nativa. En el pasado, hemos investigado la etiología de la infección por C. difficile y nuevos métodos de tratamiento con nuestros colaboradores de la Universidad de Harvard (Chen et al., 2020; Džunková et al., 2016a; Džunková et al., 2016b, Džunková et al., 2020). Nuestro plan actual es explorar el papel de los bacteriófagos introducidos al intestino de un paciente sufriendo una infección por C. difficile mediante técnicas de genómica de células individuales microbianas. Además, este método proporcionará información sobre la diversidad de las cepas de C. difficile dentro de un paciente. Esto es muy importante para el seguimiento de la transmisión entre los pacientes, ya que normalmente en los estudios epidemiológicos solo se tiene en cuenta una colonia por paciente (Džunková et al., 2016a).

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Arnau V, Díaz-Villanueva W, Mifsut Benet J, Villasante P, Beamud B, Mompó P, Sanjuan R, González-Candelas F, Domingo-Calap P, DŽUNKOVÁ M (2023): Inference of the Life Cycle of Environmental Phages from Genomic Signature Distances to Their Hosts. Viruses 15: 1196.
DŽUNKOVÁ M (2022): Single-cell Genomics for Uncovering Relationships between Bacteriophages and their Hosts. In book: Genetic Diversity - Recent Advances and Applications. IntechOpen 10.5772/intechopen.108118
Low SJ, DŽUNKOVÁ M, Chaumeil PA, Parks DH, Hugenholtz P (2019): Evaluation of a concatenated protein phylogeny for classification of tailed double-stranded DNA viruses belonging to the order Caudovirales. Nature Microbiology 4: 1306-1315.
Jarett JJ*, DŽUNKOVÁ M*, Schulz F, Roux S, Paez-Espino D, Eloe-Fadrosh E, Jungbluth SP, Ivanova N, Spear JR, Carr SA, Trivedi CB, Corsetti FA, Johnson HA, Becraft E, Kyrpides N, Stepanauskas R, Woyke T (2020): Insights into the dynamics between viruses and their hosts in a hot spring microbial mat. ISME Journal 14: 2527-2541. *-equal contribution
DŽUNKOVÁ M; Low SJ; Daly JN, Deng L, Rinke C, Hugenholtz P (2019): Defining the human gut host–phage network through single-cell viral tagging. Nature Microbiology 4: 2192-2203.
DŽUNKOVÁ M, Moya A, Vázquez-Castellanos JF, Artacho A, Chen X, Kelly C, D'Auria G (2016a): Active and secretory IgA coated bacterial fractions elucidate dysbiosis in Clostridium difficile infection. mSphere 1: e00101.
DŽUNKOVÁ M, D'Auria G, Xu H, Huang J, Duan Y, Moya A, Kelly CP, Chen X (2016b): The monoclonal antitoxin antibodies (actoxumab-bezlotoxumab) treatment facilitates normalization of the gut microbiota of mice with Clostridium difficile infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 6: 119.
DŽUNKOVÁ M, Moya A, Chen X, Kelly C, D’Auria G (2020): Detection of mixed-strain infections by FACS and ultra-low input genome sequencing. Gut Microbes 11: 305-309.
Chen X, Yang X, de Anda J, Huang J, Li D, Xu H, Shields KS, DŽUNKOVÁ M, Hansen J, Patel IJ, Yee EU, Golenbock DT, Grant MA, Wong GCL, Kelly CP. (2020): Clostridioides difficile toxin A remodels membranes and mediates DNA entry into cells to activate Toll-like receptor 9 signaling. Gastroenterology 159: 2181-2192.e1.

Metabolitos secundarios de microbios de animales marinos de cuerpo blando

Metabolitos

Los científicos buscan constantemente nuevos grupos de genes biosintéticos que podrían impulsar una investigación más detallada, incluyendo su síntesis en el laboratorio, pruebas de bioactividad in vitro, ensayos con animales de experimentación y ensayos clínicos finales. Las herramientas bioinformáticas nos permiten descubrir nuevas vías de producción de moléculas bioactivas, pero la predicción computacional no puede garantizar la funcionalidad de estos genes. Pasar del descubrimiento de los genes biosintéticos a su exploración farmacéutica requiere mucho esfuerzo y, por tanto, antes de empezar, necesitamos saber que su biosíntesis ha sido realmente funcional in vivo.

La toxicidad de los animales marinos de cuerpo blando se conoce desde hace mucho tiempo, pero los científicos en el pasado se limitaban a triturar el cuerpo del animal y probar su actividad antibacteriana, lo que les daba la impresión que el animal producía estas moléculas. El papel de los microbios simbióticos no ha sido estudiado ampliamente.

Colaboramos con científicos del DOE Joint Genome Institute, (Lawrence Berkeley National Laboratory), el Departamento de Química y Bioquímica de la Universidad de California en San Diego y el Bigelow Laboratory for Ocean Sciences, que en el 2022 han conseguido una subvención NIH (Institutos Nacionales de Salud de EEUU). Estamos utilizando sondas fluorescentes desarrolladas en UCSD para capturar microbios simbióticos en la piel de animales marinos de cuerpo blando que ayudan a su hospedador producir moléculas biosintéticas y protegerlo contra sus depredadores. Recolectamos las células que han absorbido la sonda fluorescente mediante FACS y aplicamos la genómica de células individuales microbianas para obtener genomas de las bacterias que están produciendo los metabolitos secundarios activamente. La fluorescencia representa una confirmación de que la vía biosintética en las células es realmente funcional, por lo que podemos pasar a su expresión mediante bacterias recombinantes en el laboratorio y a su caracterización bioquímica (Kim et al., 2020).

Actualmente estamos explorando animales de cuerpo blando en las aguas costeras de España, para conocer la diversidad microbiana aún inexplorada y, si tenemos suerte, vamos a descubrir las vías biosintéticas que podrían dar lugar al desarrollo de nuevos medicamentos en el futuro.