MICROSCOPIA
Las microtécnicas incluyen el uso de microscopio de luz para visualizar imágenes de preparaciones de tejidos cortados. Es imperativo por tanto, que el estudiante así como el científico experimentado entiendan los principios básicos de los microscopios ópticos para poder observar claramente las estructuras morfológicas ocultas dentro de las células y tejidos. Es más importante que uno se familiarizarse con los principales componentes del microscopio y con las técnicas más utilizadas habitualmente en microscopía óptica.
Amplificadores y microscopios
Cuando una lente óptica se usa para incrementar la imagen de un objeto nos referimos a un amplificador. Cualquier amplificador incrementa el tamaño aparente de un objeto incrementando la imagen del objeto en la retina del ojo. Generalmente el tamaño de la imagen retinal está limitada a cuan cerca puede ser emplazado un objeto visto con un solo ojo. En la práctica este ha sido estandarizado en 25 cm y se ha llamado distancia de distinción de visión. Como un objeto es traído desde infinitamente cerca al ojo, el ángulo entre una línea horizontal y la altura del objeto (ángulo visual) se ve incrementado. Esta amplifiación podemos decir que es proporcional al ángulo sostendio del objeto y Normal. Un ángulo sostenido de menos de 1º no puede ser visto por el ojo; entonces para ver dicho objeto el ángulo debe ser incrementado.
En la actualidad, y saltándonos la historia de los microscopios compuestos, podemos decir que consiste en dos componentes ópticos (por ello el término compuesto): el sistema de lentes objetivo , que tiene una distancia focal muy corta y está emplazado muy cerca del objeto; y el ocular, que tiene mayor longitud de distancia focal, menor amplificación, y que proyecta la imagen más allá, sobre la retina del ojo. Las lentes del objetivo proyectan una imagen real (la imagen intermedia) del objeto haciarriba en el cuerpo del microscopio sobre el plano de la imagen del objetivo conjugadoo imagen primaria. La distancia desde el plano focal anterior del objetivo al primer plano de la imagen dentro del cuerpo del microscopio se refiere a la longitud óptica del tubo. Dependiendo del tipo de microscopio y del ocular, el plano de imagen primaria debe estar dentro del cuerpo del microscopio o dentro del ocular. Las lentes del objetivo forman una imagen real en el cuerpo del microscopio que actúa como el objeto para la lente ocular. El ocular en cambio actúa como un amplificador simple para formar una gran imagen virtual a la distancia en la que el ojo puede distinguir de la mejor manera (25 cm). Finalmente, la imagen virtual se convierte en objeto para el ojo y es proyectada como una imagen real sobre la retina. Desde que las lentes objetivo y ocular actúan en serie, la amplificación total de un microscopio compuesto es función de la amplificación del objetivo multiplicado por la amplificación del ocular.
Podría ser posible tener cualquier combinación de objetivo y ocular. Sin embargo, es más eficiente incrementar la amplificación incrementando la amplificación de la lente objetivo (y esto incrementa la apertura numérica, NA) en vez de los oculares. Desde que la amplificación del sistema se centra en los oculares la amplificación objetiva, la amplificación de la imagen total será el mismo pero la resolución se aumentará cuando se usan una amplificación alta y el objetivo de la apertura numérica alta con un ocular de amplificación bajo.
La ventaja de tener sistemas compuestos de lentes en oposición a los amplificadores simples que es que se puede llegar a una mayor amplificación con dos lentes en vez de con una. Para lograr grandes amplificaciones con un amplificador de lentes simple, las lentes mismas deben estar emplazadas muy cerca del ojo para incrementar el ángulo de visión, trabajando sólo de una manera.
La mayoría de microscopios tienen una pieza giratoria, el revólver sobre el que hay montados distintos objetivos con diferentes amplificaciones. Mientras que el punto focal frontal de los objetivos varía, la longitud del tubo óptico debería variar para mantener la imagen enfocada. Esto es, los microscopios están diseñados para mantener el foco cuando cambian de un objetivo con una potencia a otro con una distancia física fija entre el objeto y el primer plano de imagen. Esta distancia total igua a la distancia parafocal (distancia entre la parte superior de la lente y el plano de la muestra), más la distancia mecánica del tubo- la distancia entre el objetivo sobre el plano primario de la imagen. La mayoría de los microscopios han sido estandarizados a una longitud mecánica del tubo de 160 mm (170 mm en Europa).
Opticas de corrección infinita
Los diseñadores de microscopios han adoptado diferentes diseños en las ópticas de los microscopios que llaman corrección infitita. En estos diseños, los objetivos no forman una imagen real pero tienen una longitud de tubo óptico infinita. Se requiere una lente formadora de imagen en el tubo del microscopio emplazado en diferentes posiciones ópticas y en diferentes modelos de microscopios, que convergen los rayos del objetivo sobre el primer plano de imagen. Una ventaja de este diseño es que se pueden añadir componentes ópticos como filtros polarizadores, variadores de amplificación, y otros complementos que hacen converger los haces de luz de forma conveniente.
El segundo sistema de componentes del microscopio, el ocular, actúa como un amplificador simple de la imagen intermedia. Las lentes del ocular amplifican la imagen intermedia y crean una mayor, imagen virtual que aparece sobre el ojo y que yace más allá del plano del especimen a la distancia en la que se puede distinguir con la visión.
Iluminación Köhler
Aspectos prácticos
La función de la iluminación Köhler es iluminar un especimen con un campo uniforme de luz que sea del mismo diámetro que el área de captura del objetivo. En una imagen el campo diafragma se enfoca por la lente condensadora sobre el plano del especimen, iluminando de esta manera con un cono sólido de luz homogénea. El ajuste del campo iris limita el diámetro del cono de luz (de manera que sólo ilumina el campo de visión y no más) en cualquier lente objetivo que esté siendo. Si iluminamos sólo el campo de visión, se disminuye la degradación de luz por dispersión. La iluminación Köhler es un prerequisito para todos los otros métodos de visualización.
Pasos para el ajuste de iluminación Köhler:
1.- Enfoca el especimen.
2.- Con el diafragma completamente cerrado localizado lo más cerca del origen de luz (campo iris) de manera que puedas ver los límites del diafragma.
3.- Trae los márgenes del campo iris a enfoque aumentando o disminuyendo el enfoque con la rueda del condensador. Tanto el especimen como el iris deben estar en foco.
4.- Centra la imagen del campo iris usando las ruedas de condensador-centrador.
5.- Abre el centrado y enfoca el campo iriso de maneras que los márgenes del campo iris estén más allá del campo de visión.
6.- Ajusta el condensador iris para incrementar o disminuir el contraste de la imagen. La apertura óptima depende del especimen. Nunca uses esta apertura para controlar la intensidad de luz.
7.- Ajusta la intensidad de luz con el potenciómetro o con filtros de densidad neutra (para fotografía en color).
En un microscopio con un ajuste Köhler adecuado, el contraste del especimen se obtiene ajustando el condensador del diafragma. La intensidad de iluminación se varía ajustando el voltaje de la fuente luminosa o poniendo filtros de densidad neutra frente al iluminador.
Obtención de medidas microscópicas
La obtención de medidas espaciales (longitud, altura, área, etc) de objetos microscópicos es conocido como morfometrías. Existen varios métodos por los cuales pueden ser medidos los objetos, siendo el método más común ahora el uso de adquisidores y procesadores de imágen. En este caso, una imagen de un especimen es digitalizada y guardada como un archivo de ordenador usando técnicas estádar. Como consecuencia, o simultaneamente, la imagen puede ser calibrada espacialmente, y , con el uso de herramientas de procesado de imagen, el o los objetos en cuestión pueden ser medidos. Un paso crítico en este y otros procedimientos de medición es la calibración espacial. Para precisar la calibración se usa un porta microscópico especial. Este porta tiene una regla calibrada con una medida conocida (frecuentemente) 1 mm, con esta graduación de 0.1 y 0.01 mm. El estado del micrómetro se visualiza a través del microscopio para calibrar el micrómetro ocular (medido contra la imagen del micrómetro) y teniendo el programa calculado el número de pixels por unidad conocida. La calibración espacial de la imagen debe ser analizada usando morfometrías simmples. Los análisis complejos tales como el recuento de aprtículas y determinación de volúmenes requiere técnicas más sofisticadas de estereología.