La secuenciación de genes codificantes de proteínas es una técnica cada vez más utilizada en los laboratorios de microbiología. El análisis de dichas secuencias permite establecer relaciones filogenéticas y mejorar la identificación a nivel de especie en aquellas cepas para las que el análisis del DNA ribosómico no es suficientemente resolutivo.
La elección de los genes depende del grupo microbiano al que pertenezca el aislado. Los genes más utilizados en eucariotas son: ß-Tubulina (TUB2), factor de elongación de la traducción (TEF1), gen de la actina (ACT1) y segunda subunidad mayor de la RNA polimerasa II (RPB2).
Metodología
Si el usuario ha decidido los genes a secuenciar debe enviar la referencia bibliográfica con la metodología del estudio (secuencia de los cebadores, condiciones de PCR, etc.).
En caso contrario, el personal de la CECT realizará una búsqueda bibliográfica y asesorá al cliente sobre qué gen/genes pueden ser útiles para la cepa en estudio.
Los cebadores utilizados para amplificar los diferentes genes son:
- Secuenciación parcial del gen de la ß-Tubulina (TUB2): Bt2a/Bt2b (Glass and Donaldson, 1995)
- Secuenciación parcial del factor de elongación de la traducción (TEF1): con los cebadores tef1fw/tef1rev (O'Donnell et al., 1998), secuenciación de un fragmento de 0,2 kb (intrón corto, tef1_int5, comprendido entre los exones 5 y 6 del gen). Con los cebadores EF1728F/EF1-986R (Carbone & Kohn, 1999), secuenciación de un fragmento de 0,3 kb (intrón largo, tef1_int4, comprendido entre los exones 4 y 5 del gen).
- Secuenciación parcial del gen de la actina (ACT1): CA14/CA5R (Daniel & Meyer, 2003)
- Secuenciación parcial (con lecturas en las dos direcciones) de la segunda subunidad mayor de la RNA polimerasa II (RPB2): fRPB2-5F (Liu et al. 1999) / fRPB2-414R (Quaedvlieg et al. 2011).
El DNA se amplifica mediante PCR, utilizando cebadores previamente descritos y publicados. Los productos de PCR se comprueban mediante electroforesis en gel de agarosa 1% (p/v) en tampón tris-borato EDTA a 135 V durante 25 minutos.
Como resultado del estudio se enviará la secuencia en formato fasta y un informe del resultado de la comparación con las secuencias públicas donde figura la extensión del fragmento solapado, el porcentaje de identidad y el nombre del microorganismo con un mayor grado de identidad de secuencia.
Bibliografía
Carbone, I., Kohn, L.M. (1999). A method for designing primer sets for speciation studies in fifilamentous ascomycetes. Mycologia, 91:553–556.
Daniel, H.M. & Meyer, W. (2003). Evaluation of ribosomal RNA and actin gene sequences for the identification of ascomycetous yeasts. International Journal of Food Microbiology, 86:61–78
Glass, N.L., Donaldson, G.C. (1995). Development of primersets designed for use with the PCR to amplify conserved genes from filamentous ascomycetes. Appl Environ Microb., 61:1323–1330.
Liu, Y.J., Whelen, S. and Hall, B.D. (1999). Phylogenetic relationships among ascomycetes: evidence from an RNA polymerase II subunit. Mol. Biol. Evol. 16(12):1799-1808.
O’Donnell, K., Cigelnik, E. & Nirenberg, H. I. (1998). Molecular systematics and phylogeography of the Gibberella fujikuroi species complex. Mycologia, 90:465–493.
Quaedvlieg, W., Kema, GHJ., Groenewald, JZ., Verkley. GJM., Seifbarghi, S.(2011). Zymoseptoria gen. nov.: new genus to accommodate Septorialike species occurring on graminicolous hosts. Persoonia, 26: 57–69.
