La PCR quantitativa és una modificació de la tècnica de PCR convencional que permet quantificar la quantitat inicial d'un fragment diana en present en la mostra original, ja siga DNA o RNA (cDNA).
En la Secció de Genòmica es poden aplicar dues metodologies de PCR quantitativa: PCR en temps real i PCR digital.
qPCR en Temps Real (qRT-PCR)
En teoria, hi ha una relació quantitativa entre la quantitat de la seqüència diana inicial i la quantitat del producte de PCR en qualsevol cicle de l'amplificació. Mitjançant la inclusió de fluorocroms es pot monitorar el progrés en temps real de la reacció d'amplificació, mesurant la fluorescència alliberada cada vegada que es realitza una còpia del DNA motle, ja que l'increment de la intensitat d'aquesta és proporcional a la quantitat de DNA generat.
Aplicacions:
- Estudis d'expressió gènica: quantificació absoluta amb corba patró i quantificació relativa amb gen control endogen.
- Detecció de SNPs.
- Detecció de patògens alimentaris.
- Determinació de la càrrega viral.
- Determinació de la malaltia mínima residual.
- Estudis de discriminació al·lèlica, etc.
Instrumentació
L'instrumental disponible en el laboratori és un equip Applied Biosystems model StepOne Plus que permet l'anàlisi de 96 mostres. Es pot realitzar la detecció simultània de més d'un fluoròfor i, per tant, la detecció de més d'un amplicon en un mateix tub. Es poden realitzar assajos amb SYBR Green o amb sondes marcades.
També es disposa del programa Primer Express per al disseny de sondes i primers.
Serveis que s'ofereixen
Els serveis que la secció ofereix als investigadors són els següents:
- Assessorament en el disseny de l'experiment i en l'anàlisi de les dades.
- Disseny de sondes i primers amb el programa Primer Express de Applied Biosystems.
Preparació i enviament de les mostres
L'usuari és el responsable de dur a terme les reaccions de PCR. En el laboratori de seqüenciació se li subministraran els tubs o plaques necessaris per a ser utilitzats en els equips, a més dels reactius SYBR Green PCR màster mix o TaqMan PCR màster mix, quan els sol·licite.
Els usuaris hauran de realitzar una sessió inicial d'entrenament en el laboratori del SCSIE abans de poder utilitzar l'equip.
Lliurament de resultats
S'entregarà a cada investigador una còpia del fitxer amb les dades, que poden ser analitzats instal·lant prèviament el programa proporcionat pels tècnics de la Secció de Genòmica.
PCR digital (dPCR)
Aquesta tècnica permet la quantificació absoluta d'un DNA o cDNA sense necessitat d'utilitzar una corba patró ni un gen control endogen. Les molècules de DNA o cDNA motle de la mostra se separen individualment en particions que funcionen com microcàmeres en les quals es realitzen les reaccions de PCR en paral·lel. Els productes específics es detecten utilitzant els mateixos fluorocroms que en qPCR en temps real. Quan en una partició està present la seqüència diana, s'amplifica i es genera senyal (partició positiva). Si no es produeix l'amplificació es considera partició negativa. Aplicant una distribució de Poisson, la proporció de particions positives i negatives s'utilitza per a determinar de manera absoluta el nombre de molècules diana en la mostra.
Aplicacions:
- Quantificació absoluta de càrrega viral
- Quantificació de patògens
- Generació de patrons de referència
- Quantificació d'expressió gènica
- Detecció i quantificació de GMOs
- Detecció de mutacions de baixa freqüència
- Quantificació de quimeres donant/receptor
- Anàlisi CNV
- Confirmació de variants detectades per NGS
Instrumentació
L'equip de dPCR disponible en la Secció de Genòmica és el model QuantStudio 3D de Life Technologies. El sistema d'obtenció de les particions i de realització de les amplificacions és un xip microfluídic de 20.000 pouets.
El sistema permet la detecció de més d'un fluoròfor simultàniament i es pot utilitzar SYBR Green o sondes marcades.
Serveis que s'ofereixen
- Assessorament en el disseny de l'experiment i en l'anàlisi de les dades.
- Realització de l'experiment
Preparació i enviament de les mostres
Consultar prèviament amb el personal de la secció
