Plan de trabajo
A través del objetivo 1 se inscribe el desarrollo de la acción subsiguiente en el marco de la garatía de calidad. Se trata de adaptar los protocolos que actualmente se utilizan en el laboratorio de Pharmaceutics (Washington State University) a las instalaciones del SCSIE (Servei Central de Suport a la Investigació Experimental). Se contemplan, por una parte, los referentes a los aparatos y las técnicas que se van a emplear para obtener las monocapas celulares. Por otra, se abordarán también los relativos a la conservación de las líneas celulares a partir de los clones cedidos por la Dra. Monique Rousset, del Centre de Recherche Cellulaire de Paris (líneas ATCC y TC7). El tiempo previsto para llevar a cabo esta fase es de 3 meses.
Los objetivos 2, 3 y 4 requerirán un periodo de 7 meses cada uno de ellos. Para proceder a su materialización el protocolo de trabajo tiene aspectos comunes, que se indican a continuación:
- Obtención de las líneas celulares para realizar los ensayos de permeabilidad:
Las células se siembran en membranas adecuadas, a razón de 200.000 células/4.2 cm2. Se mantienen, durante 19-22 días, a 37° C en una atmósfera con 90% de humedad y 5% de CO2, en un medio que contiene un 15% de suero bovino fetal, hasta el día anterior al ensayo.
Para realizar el ensayo de permeabilidad se extraen las monocapas de la cámara, se aspira el medio de cultivo y se procede al lavado de la misma. A continuación se mide la resistencia eléctrica (TEER) con objeto de comprobar la integridad de la monocapa. Una vez asegurada, se incuban durante 1 hora para permitir que las células expulsen completamente todo residuo.
El
ensayo de permeabilidad se realiza en un incubador de temperatura controlada,
37° C, con una agitación de 50 r.p.m. El dispositivo utilizado para el estudio
de permeabilidad se esquematiza en la siguiente figura:
Para caracterizar la penetración del compuesto a ensayar se dispone una disolución del mismo en la cámara que actuará como dadora y se determinan las cantidades acumuladas, en el compartimento que actúa de receptor, en función del tiempo. Así, por ejemplo, para determinar el flujo apical se dispone la solución en la cámara apical y se toman muestras en la basolateral.
- Valoración de las muestras:
El análisis de las muestras se llevará cabo por cromatografía líquida de alta resolución (CLAR), con detección fluorescente. Los métodos de análisis utilizados han sido previamente establecidos y validados adecuadamente en nuestro laboratorio.
- Tratamiento cinético de los datos:
La cinética que caracteriza el proceso de penetración a través de las células es la siguiente:
Q/t=P*Ci*A
En la que Q/t representa la velocidad de permeación, P el coeficiente de permeabilidad, Ci la concentración inicial de la sustancia en el compartimento dador y A el área de penetración. La regresión lineal de las cantidades analizadas frente al tiempo permite determinar el coeficiente de permeabilidad en cada situación. Se debe caracterizar ambos flujos (apical y basolateral) ya que la penetración neta de un compuesto depende de la magnitud relativa de ambos. Cuando un compuesto se absorbe en las células gastrointestinales únicamente por difusión pasiva el flujo medido en ambas direcciones es idéntico. El hecho de detectar diferencias entre ambos permite establecer hipótesis sobre la existencia de sistemas activos de transporte en un sentido o en otro.
En este aspecto, algunas cepas celulares procedentes de carcinoma de colon resultan de gran utilidad para detectar y estudiar deficiencias de absorbabilidad derivadas de la disminución de la fracción de fármaco absorbida por acción de la glicoproteína P. De hecho, las líneas celulares de las cepas TC7 sobreexpresan el gen que codifica la glicoproteína P, transportador activo situado en la membrana de los enterocitos que actúa transportando las sustancias que han sido absorbidas de nuevo al lumen intestinal, de manera que hace menos rentable el proceso. Es decir con esta línea celular será posible el estudio tanto de compuestos que se absorben mediante procesos de difusión pasiva como aquellos otros que estén sometidos a la acción de este sistema transportador.
d. Análisis de los resultados
Los resultados que se obtengan en los diferentes ensayos de permeabilidad se someterán al tratamiento matemático-estadístico adecuado.
Objetivo 2: Los coeficientes de permeabilidad obtenidos para las moléculas atenolol, manitol, metoprolol y propanolol se compararán estadísticamente con los valores señalados en la bibliografía. Esta comparación tiene por objetivo comprobar la validez y adecuación de las condiciones de trabajo, puesto que deben ser capaces de reproducir los resultados obtenidos en otros laboratorios, trabajando en las mismas condiciones.
Objetivo 3: Se estudiará la relación que existe entre los coeficientes de permeabilidad obtenidos en estos ensayos, para una serie de fluoroquinolonas, y la permeabilidad obtenida en nuestro laboratorio, en trabajos ya realizados "in situ", en animales de experimentación. Asimismo, se establecerá la relación de los coeficientes de permeabilidad obtenidos y la biodisponibilidad ya determinada "in vivo". Los resultados que se obtengan permitirán establecer la idoneidad de las monocapas de células Caco-2 para predecir características de absorbabilidad de moléculas nuevas en las primeras fases de desarrollo de nuevos fármacos.
Objetivo 4: Se procederá a la comparación estadística entre los coeficientes de permeabilidad en cada una de las direcciones. En caso de establecerse diferencias significativas se procederá a la cuantificación del proceso de transporte debido a la influencia de la glicoproteína P. Se realizarán estudios específicos en monocapas de TC7 y mediante ensayos de permeabilidad de las sustancias en presencia de inhibidores de este sistema portador.
El desarrollo de los objetivos planteados permitirá la consolidación de un grupo de investigación capaz de ofertar la realización de ensayos de absorbabilidad y predicción de la misma mediante cultivos celulares, a grupos de investigación que los requieran. Éstos constituirán una oferta tecnológica de la Univesitat de València y por ello de la Comunidad Valenciana. El producto final concreto de este proyecto lo constituye la posibilidad de ofertar la determinación de permeabilidades a través de un método validado, fiable y con capacidad predictiva. Sin duda puede representar un punto de partida de relevancia a la hora de seleccionar moléculas nuevas, que posean propiedades terapéuticas adecuadas y de las que se desee conocer su potencial absorción con el fin de formularlas en preparados de administración oral. Este constituye el objetivo 5.
Los resultados obtenidos se difundirán a través de los medios específicos a las industrias farmacéuticas y de manera general a través de su inclusión en la página web del Departamento.