El descubrimiento de nuevos fármacos es un largo proceso y requiere de equipos de investigación multidisciplinarios y de un absoluto rigor científico. El descubrimiento y desarrollo de un nuevo fármaco suele durar entre 7 y 15 años y tiene un coste promedio asociado en torno a los 400 millones de euros. El proceso consta de distintas etapas, siendo en las iniciales donde la contribución de la investigación básica es fundamental. Hasta donde llegan nuestras referencias bibliográficas, en la Comunitat Valenciana nunca se ha descubierto un fármaco ni existen empresas farmacéuticas comparables a las de otras comunidades autónomas con similar nivel de renta per capita como Madrid, Cataluña y el País Vasco. Una posible contribución a paliar esta situación e instaurar o generar nuevas iniciativas en la Comunitat Valenciana de empresas de este sector, debe dirigirse hacia el apoyo y consolidación de grupos multidisciplinarios cuya investigación defina las bases para la identificación de nuevas dianas terapéuticas y de sus moduladores.

La última década de investigación en biología celular ha puesto de manifiesto que las interacciones proteína-proteína, tanto entre proteínas solubles como a nivel de membrana, constituyen un mecanismo clave para la regulación celular. La caracterización de estas interacciones, junto con la identificación de moduladores, ofrece nuevas oportunidades en biotecnología. En la presente solicitud se propone utilizar moduladores de interacciones proteína-proteína de relevancia biológica para el descubrimiento de nuevos candidatos a fármacos. La propuesta se centra en dos procesos biológicos fundamentales, la muerte celular programada (apoptosis) y las interacciones mediadas por integrinas responsables de la formación de agregados de plaquetas causantes de trombosis y metástasis tumoral. En el proyecto de investigación se pretende utilizar técnicas de biología química para modificar/regular la señalización celular asociada a los procesos mencionados. La identificación de los moduladores se lleva a cabo a partir de dos aproximaciones complementarias. La utilización de ensayos in vitro y química combinatoria de péptidos y moléculas orgánicas de bajo peso molecular (SOM) y la identificación de compuestos bioactivos en venenos de serpientes.

La explotación de SOM forma parte de la historia humana, desde el uso de alcaloides hasta la introducción en el siglo XX de antibióticos como la penicilina (origen natural) o la ciprofloxacina (origen sintético). El estudio de los sistemas biológicos mediante intervención química se denominó inicialmente ‘genética química’ aunque más recientemente se ha adaptado el término más amplio ‘biología química’. Ésta pretende la utilización de herramientas químicas para la resolución de problemas biológicos. Por su naturaleza es multidisciplinar. Conceptualmente el objetivo se basa en la utilización de SOM y péptidos para la comprensión de la biología celular a nivel molecular y su proyección de futuro en biotecnología ha despertado el interés de las empresas farmacéuticas. En las últimas décadas, la mayoría de los fármacos se han desarrollado como inhibidores de enzimas. Sin embargo, en la actualidad las empresas están explorando nuevas posibilidades. Entre los potenciales candidatos destacan los inhibidores de interacciones proteína-proteína. Muchas proteínas, incluyendo enzimas, llevan a cabo su función biológica mediante la interacción con otras proteínas. La inhibición de estas interacciones es una forma de modulación de la actividad. La diversidad estructural presente y el gran número de interacciones posibles y específicas ofrecen un interesante panel de posibles dianas farmacológicas. La identificación de SOM y péptidos que inhiben interacciones entre proteínas de alto interés en biomedicina ha confirmado las observaciones iniciales. Incluso se ha propuesto muy recientemente que los inhibidores de interacciones proteína-proteína pueden ser de utilidad para mejorar la denominada ‘personalización de las medicinas’.

De igual manera, el interés por los venenos de serpientes con fines curativos forma también parte de la historia humana. Los venenos, son mezclas complejas de moléculas farmacológicamente activas cuyos efectos biológicos también son complejos. La presunción del poder curativo de las serpientes venenosas se pierde en el origen de los tiempos y se basa en un pensamiento simplista muy extendido: «Quien porta el veneno debe llevar el antídoto». Las tribus indígenas de todo el mundo cuentan con remedios sacados de las diferentes partes del cuerpo de las serpientes y la ciencia moderna ha demostrado, que muchas serpientes venenosas portan el remedio para muchas enfermedades. Efectivamente, los varios cientos de especies de ofidios potencialmente peligrosos para el hombre albergan en sus glándulas del veneno un arsenal químico, cuya composición y acción biológica han sido refinadas a lo largo de millones de años de evolución y que representa tanto un arma mortífera para la presa como una farmacopea natural cuyo enorme potencial biotecnológico y clínico está siendo activamente explorado. Así, los antiagregantes de plaquetas Tirofiban (Aggrastat®) y Eptifibatide (Integrilin®) están basados en la secuencia RGD de las disintegrinas, potentes inhibidores de la agregación plaquetaria presentes en venenos de vipéridos y crotálidos, y son de uso clínico para la prevención de episodios tromboembolíticos. Las serinoproteasas Ancrod®, Reptilase® (o Batroxobin®) y Defibrase®, aisladas de los venenos de Calloselasma rhodostoma, Bothops atrox y Bothrops moojeni, respectivamente, han sido aprobadas para terapias desfibrinantes (eliminación de fibrinógeno/fibrina coagulante) con objeto de paliar los devastadores efectos del infarto de miocardio o cerebral. Alfimeprase® (Nuvelo-R&D), una metaloproteasa fibrinolítica recombinante derivada de fibrolasa del veneno de Agkistrodon contortrix ha completado la fase II de ensayo clínico, y Captopril Cinfa® (Bristol-Myers), el primer inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina I que produce una relajación de los vasos sanguíneos y reduce la presión arterial, se basó en la estructura de los péptidos potenciadores de la bradiquinina aislados del veneno de Bothrops jararacá. Asímismo, la disintegrina contortrostatina, potente inhibidor de la integrina v3, aislada del veneno de Agkistrodon contortrix contortrix, está siendo investigada por el grupo del Prof. Francis Markland (Univ. California) por su potencial antiangiogénico. Es altamente estimulante para el investigador biomédico que las mismas actividades biológicas que convierten al veneno en un arma letal para las presas naturales de las serpientes puedan servir - administradas adecuadamente- para el tratamiento de enfermedades. Resulta realmente fascinante descifrar los mecanismos moleculares desarrollados en el curso de la Evolución para intensificar el arsenal tóxico de las serpientes, convencidos de que dicho conocimiento es necesario para revertir en el laboratorio la estrategia de la Selección Natural y transformar toxinas letales en fármacos que puedan llegar a salvar vidas. En particular, esta parte del proyecto se sustenta en la hipótesis de que el estudio detallado de correlaciones estructura-función de toxinas de venenos de serpientes, y en particular de aquellas que inhiben la angiogénesis bloqueando selectivamente a la integrina 11, representa una estrategia para el descubrimiento de potenciales herramientas moleculares para la visualización de tumores en crecimiento y eventualmente para detener la progresión tumoral.

La apoptosis (muerte celular programada) es un proceso celular implicado en el recambio celular y en el sistema inmune. Se han encontrado evidencias de apoptosis desregulada en enfermedades neurodegenerativas y cáncer. Además, la apoptosis es responsable de la muerte celular observada en procesos de isquemia/reperfusión asociados a transplantes. Después de la activación por distintos estímulos las rutas apoptóticas confluyen en la activación de unas proteasas denominadas caspasas. Las denominadas efectoras (caspasa-3 y -7) son las responsables del desmantelamiento celular, mientras que las caspasas iniciadoras (-8, -9 y -10) son las que activan a las efectoras. Una de las vías de activación de apoptosis implica a la mitocondria (vía intrínseca) que utiliza caspasa-9 como iniciadora. La activación está mediada por la liberación de citocromo c y otras proteínas proapoptóticas desde el espacio intermembrana mitocondrial. La formación del apoptosoma (complejo multiprotéico) es un evento clave en esta vía y está formado Apaf-1, citocromo c, y procaspasa-9. La función principal del apoptosoma es activar la caspasa-9. Para identificar moléculas paliativas de los efectos de un exceso de apoptosis en, por ejemplo, algunas enfermedades neurodegenerativas, rechazo a transplantes y procesos isquémicos, las investigaciones se han centrado en las caspasas efectoras. Sin embargo, los inhibidores de caspasas desarrollados hasta el momento, por distintos motivos, adolecen de muchos problemas de biodistribución y la opinión generalizada es que no superarán los controles requeridos para ser aprobados por las agencias regulatorias. Nuestra hipótesis se basó en considerar de interés farmacológico las interacciones proteína-proteína, que conducen a la activación de la ruta. En concreto, definimos la modulación de la formación del apoptosoma como diana farmacológica. En nuestro laboratorio, utilizando distintas estrategias se han identificado inhibidores de primera generación que mediante su unión a Apaf-1, inhiben la actividad enzimática del apoptosoma y decrecen el fenotipo apoptótico en modelos celulares de apoptosis. Por otra parte, con el objetivo de aumentar la viabilidad de los inhibidores y su apropiada liberación intracelular se han sintetizado polímeros para la liberación controlada del fármaco conjugado y moléculas heterocíclicas con un perfil farmacológico optimizado. Estos descubrimientos han llevado también a la obtención de registro de patentes y a despertar el interés de distintos grupos de investigación básica y aplicada por nuestros compuestos. Además se ha firmado un protocolo de transferencia al sector industrial con una empresa farmacéutica. En el presente proyecto se propone la caracterización a nivel molecular del sitio de unión de los inhibidores en Apaf-1 y el estudio de las consecuencias a nivel celular de la inhibición selectiva del apoptosoma en distintas condiciones. En particular, observaciones recientes de nuestro laboratorio en colaboración con el laboratorio del Dr. Guido Kroemer (INSERM, U848 and Institut Gustave Roussy, Villejuif, France) sugieren que la inhibición selectiva de Apaf-1, pero no de caspasas, previene la liberación de citocromo c de la mitocondria15. Este hecho refuerza la estrategia de inhibición de Apaf-1 como diana terapéutica para prevenir apoptosis celular no deseada pero además, desde el punto de vista de investigación básica, plantea nuevas cuestiones sobre el mecanismo molecular del proceso de señalización y posiblemente implique una actividad dependiente de Apaf-1 sobre la mitocondria. La liberación de citocromo c desde el espacio intermembrana mitocondrial es uno de los eventos celulares que se ha propuesto como el punto de no retorno en el mecanismo de muerte celular programada. Sin embargo, la rotundidad de esta afirmación ha sido recientemente cuestionada. En cualquier caso la liberación de citocromo c implica la apertura del denominado poro de transición a permeabilidad mitocondrial (PTPM). La apertura del PTPM es un proceso complejo en el que se ha descrito que participan las proteínas de la familia Bcl-2. Esta familia de proteínas la componen miembros pro- y antiapoptóticos y su actividad está regulada por un intrincado equilibrio basado en interacciones proteína-proteína con la participación de la membrana. Se ha propuesto además, una posible interacción entre Apaf-1 y miembros proapoptóticos de la familia Bcl-2. En el marco del presente proyecto se pretende analizar las consecuencias de esta interacción y su influencia sobre la protección de la integridad mitocondrial observada para los inhibidores de Apaf-1. Además, en nuestra opinión el papel de la membrana es clave. En este sentido, cabe mencionar que en colaboración con el laboratorio de la Dra. Petra Schwille (Biophysics Group, BIOTEC, TU Dresden, Germany), hemos puesto de manifiesto que la interacción que la interacción entre Bid, tBid y Bcl-xL, está fuertemente regulada por la membrana. En concreto, un péptido sintético derivado de Bid es capaz de romper la interacción entre tBid y Bcl-xL en disolución pero no en el entorno de la membrana plasmática. Estos resultados sugieren que las interacciones entre proteínas pro- y antiapotósicas no son de la misma naturaleza cuando se analizan únicamente los fragmentos solubles que cuando estas interacciones se analizan en membranas modelo utilizando las proteínas completas incluyendo los fragmentos transmembrana. Estas observaciones, aunque son novedosas en el campo de la familia de proteínas Bcl-2, tiene precedentes en cuanto a la importancia de interacciones selectivas entre proteínas a nivel de membrana y su importancia en rutas de señalización celular. En efecto, el aumento del número de proteínas de membrana de las que se ha resuelto la estructura tridimensional ha permitido un mejor conocimiento de cómo se lleva a cabo el plegamiento y empaquetamiento de sus fragmentos transmembrana (TM). Cabe destacar las proteínas que tienen un solo TM que dirigen y regulan interacciones proteína-proteína de vital importancia y participan en la transducción de señal a través de la bicapa lipídica. Los TM se han implicado en cambios conformacionales dinámicos que regulan dichas señales. Las hélices TM participan, junto con los dominios solubles de las proteínas en el ajuste fino de los cambios conformacionales que inician los procesos de señalización. Estos cambios se propagan a través de la membrana dependientes del estado de oligomerización y orientación de las hélices TM. Un ejemplo muy interesante está constituido por las integrinas. Éstas son complejos modulares de señalización que reconocen distintos ligandos. Se conocen hasta 24 complejos heterodímeros / compuestos por combinaciones de 18 subunidades y 8 subunidades . La mayoría de las integrinas existen en equilibrio entre un estado inactivo y un estado activo capaz de unir su ligando extracelular. En este proyecto se plantea como hipótesis la existencia de un equilibrio dinámico, similar al descrito para las integrinas, entre las proteínas pro- y antiapoptóticas de la familia Bcl-2 en la membrana.

Interacción integrina/disintegrina. La interacción entre integrinas de la superficie celular y componentes de la matríz extracelular constituye un mecanismo fundamental de control de la adhesión y migración celular. Señales transmitidas desde la región extracelular a los dominios intracelulares de miembros de la familia de las integrinas modulan la expresión de genes que regulan la supervivencia, proliferación y migración celular. Las disintegrinas fueron descritas en el laboratorio de Stephan Niewiarowski (Temple University, Philadelphia, USA) a finales de la decada de 1980 como potentes inhibidores de la agregación plaquetaria. Posteriormente ha quedado demostrado que la familia de las disintegrinas ha desarrollado un panel restringido, pero selectivo, de motivos de inhibición de las integrinas de las familias b1 y b3. Así, además de los motivos de inhibición plaquetaria (RGD, KGD, WGD), que también bloquean con diferente afinidad y potencia la unión de otras integrinas a sus ligandos naturales (ej. a5b1 a fibronectina; a8b1 a tenascina C, y avb1 y avb3 a vitronectina), se han caracterizado disintegrinas que poseen tripéptidos activos frente a otros sistemas de interacción integrina-ligando. Los motivos VGD y MGD presentan selectividad por la integrina a5b1; el tripéptido MLD bloquea la función de las integrinas α3β1, α4β1, α6β1, α7β1, α9β1; y los motivos KTS y RTS antagonizan selectivamente la unión de colágeno I y IV a la integrina a1b1. El mapeo de los tripéptidos activos de disintegrinas sobre el árbol filogenético de las cadenas de integrinas (que confieren la especificidad de unión de ligandos a heterodímeros que poseen una subunidad común), sugiere una adaptación evolutiva de las disintegrinas a los lugares de unión de ligandos de las integrinas.

Las integrinas diana de las diferentes disintegrinas participan en diversos procesos patológicos: la integrina αIIbβ3 es responsable de la formación de los agregados de plaquetas causantes de trombosis e isquemia cardíaca; la integrina αvβ3 desempeña un papel relevante en procesos de metástasis tumoral; las integrinas α4β1, α4β7 y α9β1 participan en procesos de inflamación y autoinmunidad; las integrinas α1β1 y αvβ3 han sido implicadas en el mecanismo de neovascularización (angiogénesis) tumoral. Los antagonistas de estas integrinas representan, por tanto, potenciales dianas terapéuticas. En el grupo de investigación, se ha descrito la producción recombinante de la disintegrina jerdostatina de Trimeresurus jerdonii. Jerdostatina posee el tripéptido RTS y forma con obtustatina (Vipera lebetina obtusa), viperistatina (Vipera palestinae) y lebestatina (Macrovipera lebetina transmediterranea) el grupo de disintegrinas cortas que inhiben selectivamente a la integrina α1β1 in vitro y la angiogénesis in vivo impidiendio la participación de este receptor en el mecanismo de neovascularización (angiogénesis) que los tumores requieren para obtener los nutrientes, oxígeno, etc. necesarios para su crecimiento. Actualmente, la parte del grupo dirigida por el Dr. J Calvete, que desarrolla su línea de investigación en el Instituto de Biomedicina de Valencia, está generando modelos murinos transgénicos condicionales para la disintegrina jerdostatina con los que evaluar la efectividad antitumoral de la disintegrina in vivo. Además, la integrina α1β1 parece jugar algún papel en procesos biológicos tales como psoriasis, astma, alergias, rechazo de órganos, y restenosis arterial tras angioplastia. Los efectos del bloqueo selectivo de la integrina α1β1 en estos procesos no han sido estudiados en detalle. En el presente proyecto se propone llevar a cabo este tipo de estudios al tiempo que se le añaden aspectos novedosos sobre el estudio del equilibrio conformacional en membrana de este tipo de proteínas. Como se ha comentado anteriormente, el equilibrio dinámico del receptor integrina puede ser modulado por la unión del ligando (disintegrina) pero también, como se ha descrito recientemente, las interacciones del receptor con los complejos de señalización celular pueden ser modificados por péptidos sintéticos.

Objetivos

A.- Biología química de interacciones proteína-proteína en apoptosis.

A.1. Apoptosoma. Caracterización a nivel molecular del sitio de unión de los inhibidores a Apaf-1. Técnicas biofísicas de caracterización estructural. Caracterización de los efectos de la inhibición selectiva del apoptosoma en células. Análisis proteómicos. Análisis del mecanismo molecular de protección mitocondrial por Apaf-1.
A.2. Estudio del equilibrio dinámico en membrana de proteínas pro- y antiapoptóticas de la familia Bcl-2.

B.- Interacción integrina/disintegrina.
Desarrollo de modelos murinos transgénicos condicionales para la disintegrina jerdostatina con los que evaluar la efectividad antitumoral de la disintegrina in vivo. Diseño, síntesis y evaluación biológica de péptidos sintéticos moduladores de la interacción entre disintegrina jerdostatina y la integrina 11. Establecimiento de la estructura cristalina de complejos 11-jerdostatina.