"Cristina Rusu, estudiant del Màster en Bioinformàtica, i del programa de Doctorat Tecnologies de la Informació, Comunicacions i Computació, defensa la seua tesi sobre noves estratègies de disseny d'engreixadors per a PCR, en el I2SysBio"
Aquesta tesi, codirigida per Vicente Arnau i Carmen Ivorra, és fruit de la col·laboració de l'I2SysBio amb l'empresa Sequencing Multiplex SL i en ella es proposen tres estratègies optimitzades de disseny d'encebadors per a PCR amb l'objectiu de satisfer les necessitats de diferents aplicacions d'aquesta tecnologia d'amplificació. Part dels resultats de la investigació s'han publicat en la revista BMC Genomics. La tesi es va defensar el 7 de març de 2025.
Malgrat l'augment de noves tecnologies i aplicacions basades en PCR, el disseny d'encebadors continua sent un repte i un coll de botella per a moltes configuracions, requerint diverses rondes d'optimització. Els encebadors determinen l'especificitat i l'eficiència de l'amplificació, així com la reproductibilitat. Tots els encebadors han de ser específics per al seu objectiu i no amplificar seqüències espúries, com a dímers d'encebadors o regions fora de la regió d’interès (ROI). En la present tesi doctoral, titulada “Bioinformatic Pipelines to the Rescue of Primer Design: Development of DrPrimer, EOSAL-Primer and ExonSurfer for Specific PCR Applications”, es presenten tres processos diferents de disseny d'encebadors, dirigits a tres aplicacions de PCR amb requisits específics.
En primer lloc, es proposa un procés de disseny d'encebadors destinat a la creació de biblioteques basades en amplicons per a panells de gens específics: DrPrimer. Un pas clau de la seqüenciació dirigida és l'enriquiment de les ROI, que sol dur-se a terme mitjançant una PCR multiplex, creant una biblioteca basada en amplicons. En els casos en què es busquen regions àmplies, és necessari dissenyar amplicons en mosaic. Això, juntament amb els requisits addicionals d'una PCR multiplex, fa que el disseny manual siga un procés problemàtic. Els encebadors que produeixen amplicons superposats han de col·locar-se en grups de reacció separats i, atès que és preferible la menor quantitat de grups per a reduir els costos i el pipetejat, és necessari verificar tots els encebadors d'un mateix grup per a l'amplificació de dímers o productes fora d'objectiu. DrPrimer dissenya múltiples encebadors candidats, que es filtren en funció de la seua tendència a crear dímers i la seua especificitat. DrPrimer incorpora un nou model de predicció de cobertura que té en compte tots els encebadors i els seus grups designats, i informa quins d'ells produiran amplicons amb una cobertura inferior a la mitjana. Com a avaluació final del mètode, es van triar 10 gens d'un panell relacionat amb la diabetis i es van comparar els encebadors naïfs amb el panell dissenyat amb DrPrimer, demostrant-se que els encebadors suggerits per DrPrimer produeixen un major percentatge de lectures diana.
En segon lloc, es va desenvolupar EOSAL-Primers, una aplicació centrada en el disseny d'encebadors necessaris per a la tècnica EOSAL-CNV. Els panells EOSAL-CNV han de dissenyar-se de manera que cada amplicó tinga una longitud única. Per a resoldre aquest problema, es van crear múltiples encebadors candidats de diferents grandàries per a cada ROI i es va utilitzar un algorisme de ramificació i enllaç que redueix en gran manera la llista de candidats a només combinacions compatibles.
Finalment, es presenta ExonSurfer, una eina web integral destinada al disseny d'encebadors per a RT-qPCR amb colorants intercalats. Aquest procés de disseny d'encebadors se centra en experiments d'expressió gènica en els quals l'amplificació de DNA genòmic és un contaminant. Els encebadors es dissenyen per a abastar unions exó-exó i es filtren segons la seua especificitat i tendència a formar dímers. El procés està integrat en una aplicació web fàcil d'usar, amb eines de visualització d'amplicons. ExonSurfer s'ha provat en un cas real, demostrant una alta precisió i especificitat, la qual cosa el converteix en una eina clau en l'anàlisi de l'expressió gènica.
Cristina Rusu realitzà la seua investigació doctoral com a resultat de la col·laboració entre el grup de Teoria, Bioinformàtica i Computació de l'I2SysBio, amb la codirecció de Vicente Arnau, professor de la Universitat de València, i l'empresa Sequencing Multiplex SL (Parc Científic de la UV), amb la codirecció de Carmen Ivorra, directora científica de l'empresa. Durant el desenvolupament de la tesi, Cristina Rusu gaudí d'un contracte del programa de Doctorat Industrial de l'Agència Estatal d'Investigació (AEI). Així mateix, va realitzar una estada d'investigació en el laboratori de Johanna Gostner en el Institute of Medical Biochemistry, Medical University of Innsbruck. El tribunal qualificador va estar format per Maria Vinaixa (Universitat Rovira i Virgili), Martie Verschuren (Avans University of Applied Sciences) i Mária Džunková (I2SysBio), que va qualificar la tesi com a excel·lent.
