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DEFENSA TESIS MÁSTER BIOINFORMÁTICA

  • 10 marzo de 2025

"Cristina Rusu, estudiante del Máster en Bioinformática, y del programa de Doctorado Tecnologías de la Información, Comunicaciones y Computación, defiende su tesis sobre nuevas estrategias de diseño de cebadores para PCR, en el I2SysBio"

Esta tesis, codirigida por Vicente Arnau y Carmen Ivorra, es fruto de la colaboración del I2SysBio con la empresa Sequencing Multiplex SL y en ella se proponen tres estrategias optimizadas de diseño de cebadores para PCR con el objetivo de satisfacer las necesidades de diferentes aplicaciones de esta tecnología de amplificación. Parte de los resultados de la investigación se han publicado en la revista BMC Genomics. La tesis se defendió el 7 de marzo de 2025.

A pesar del aumento de nuevas tecnologías y aplicaciones basadas en PCR, el diseño de cebadores sigue siendo un reto y un cuello de botella para muchas configuraciones, requiriendo varias rondas de optimización. Los cebadores determinan la especificidad y la eficiencia de la amplificación, así como la reproducibilidad. Todos los cebadores deben ser específicos para su objetivo y no amplificar secuencias espurias, como dímeros de cebadores o regiones fuera de la región de interés (ROI). En la presente tesis doctoral, titulada “Bioinformatic Pipelines to the Rescue of Primer Design: Development of DrPrimer, EOSAL-Primer and ExonSurfer for Specific PCR Applications”, se presentan tres procesos diferentes de diseño de cebadores, dirigidos a tres aplicaciones de PCR con requisitos específicos.

En primer lugar, se propone un proceso de diseño de cebadores destinado a la creación de bibliotecas basadas en amplicones para paneles de genes específicos: DrPrimer. Un paso clave de la secuenciación dirigida es el enriquecimiento de las ROI, que suele llevarse a cabo mediante una PCR multiplex, creando una biblioteca basada en amplicones. En los casos en que se buscan regiones amplias, es necesario diseñar amplicones en mosaico. Esto, junto con los requisitos adicionales de una PCR multiplex, hace que el diseño manual sea un proceso problemático. Los cebadores que producen amplicones superpuestos deben colocarse en grupos de reacción separados y, dado que es preferible la menor cantidad de grupos para reducir los costes y el pipeteo, es necesario verificar todos los cebadores de un mismo grupo para la amplificación de dímeros o productos fuera de objetivo. DrPrimer diseña múltiples cebadores candidatos, que se filtran en función de su tendencia a crear dímeros y su especificidad. DrPrimer incorpora un novedoso modelo de predicción de cobertura que tiene en cuenta todos los cebadores y sus grupos designados, e informa cuáles de ellos producirán amplicones con una cobertura inferior a la media. Como evaluación final del método, se eligieron 10 genes de un panel relacionado con la diabetes y se compararon los cebadores naifs con el panel diseñado con DrPrimer, demostrándose que los cebadores sugeridos por DrPrimer producen un mayor porcentaje de lecturas diana.

En segundo lugar, se desarrolló EOSAL-Primers, una aplicación centrada en el diseño de cebadores necesarios para la técnica EOSAL-CNV. Los paneles EOSAL-CNV deben diseñarse de manera que cada amplicón tenga una longitud única. Para resolver este problema, se crearon múltiples cebadores candidatos de diferentes tamaños para cada ROI y se utilizó un algoritmo de ramificación y enlace que reduce en gran medida la lista de candidatos a solo combinaciones compatibles.

Por último, se presenta ExonSurfer, una herramienta web integral destinada al diseño de cebadores para RT-qPCR con colorantes intercalantes. Este proceso de diseño de cebadores se centra en experimentos de expresión génica en los que la amplificación de DNA genómico es un contaminante. Los cebadores se diseñan para abarcar uniones exón-exón y se filtran según su especificidad y tendencia a formar dímeros. El proceso está integrado en una aplicación web fácil de usar, con herramientas de visualización de amplicones. ExonSurfer se ha probado en un caso real, demostrando una alta precisión y especificidad, lo que lo convierte en una herramienta clave en el análisis de la expresión génica.

Cristina Rusu realizó su investigación doctoral como resultado de la colaboración entre el grupo de Teoría, Bioinformática y Computación del I2SysBio, con la codirección de Vicente Arnau, profesor de la Universitat de València, y la empresa Sequencing Multiplex SL (Parc Científic de la UV), con la codirección de Carmen Ivorra, directora científica de la empresa. Durante el desarrollo de la tesis, Cristina Rusu disfrutçó de un contrato del programa de Doctorado Industrial de la Agencia Estatal de Investigación (AEI). Asimismo, realizó una estancia de investigación en el laboratorio de Johanna Gostner en el Institute of Medical Biochemistry, Medical University of Innsbruck. El tribunal calificador estuvo formado por Maria Vinaixa (Universitat Rovira i Virgili), Martie Verschuren (Avans University of Applied Sciences) y Mária Džunková (I2SysBio), que calificó la tesis como sobresaliente.