La secuenciación de genes codificantes de proteínas es una técnica cada vez más utilizada en los laboratorios de microbiología. El análisis de dichas secuencias permite establecer relaciones filogenéticas y mejorar la identificación a nivel de especie en aquellas especies para las que el análisis del DNA ribosómico no es suficientemente resolutivo.
La elección de los genes depende del grupo microbiano al que pertenezca el aislado. Algunos de los genes más utilizados en procariotas son: recA, gyrB, ftsZ, rpoD, mreB.
Material necesario
Preferentemente, un cultivo activo de la cepa (placa Petri o tubo de agar inclinado). También se acepta DNA, acompañado de una imagen de un gel donde se observe su integridad. Se necesita al menos 1 µg de DNA resuspendido en agua ultrapura o en tampón TE a una concentración final de 40-50 ng/µl. El DNA debe ser de buena calidad (A260/A280 entre 1,8 y 2)
Metodología
Si el usuario ha decidido los genes a secuenciar debe enviar la referencia bibliográfica con la metodología del estudio (secuencia de los cebadores, condiciones de PCR, etc.).
En caso contrario, el personal de la CECT realizará una búsqueda bibliográfica y asesorá al cliente sobre qué gen/genes pueden ser útiles para la cepa en estudio.
La secuenciación se hará siguiendo la metodología descrita en la bibliografía para el gen escogido.
La secuenciación de los fragmentos de PCR se lleva a cabo en un secuenciador ABI 3730xl (Applied Biosystems) utilizando los mismos cebadores de la PCR a una concentración de 5 nM.
Como resultado del estudio se enviará la secuencia en formato fasta y un informe del resultado de la comparación con las secuencias públicas donde figura la extensión del fragmento solapado, el porcentaje de identidad y el nombre del microorganismo con un mayor grado de identidad de secuencia.
