Logo de la Universdad de Valencia Logo del portal

  • Serveis

Secuenciación parcial del gen 16S rRNA:

Técnica útil y ampliamente utilizada para la identificación de cepas bacterianas como mínimo a nivel de género, y muchas veces a nivel de especie. En la CECT se secuencian aproximadamente los primeros 1000 nucleótidos del gen, que incluyen zonas hipervariables donde se acumulan la mayoría de diferencias nucleotídicas entre especies.

En el caso de que el resultado obtenido no sea suficientemente discriminatorio para llegar a la identificación a nivel de especie, el personal de la CECT contactará con el cliente para informarle del resultado y de la posibilidad de mejorar la identificación completando la secuencia del gen 16S rRNA o si es necesario abordar otro tipo de técnicas.

Secuenciación completa del gen 16S rRNA (aproximadamente 1500 nucleótidos):

Esta técnica puede mejorar el resultado de la identificación a nivel de especie en algunos géneros bacterianos. Además, es imprescindible para la descripción de la cepa tipo de una nueva especie procariota (Stackebrandt et al., 2002).

Material necesario

Preferentemente, un cultivo activo de la cepa (placa Petri o tubo de agar inclinado). También se acepta DNA, acompañado de una imagen de un gel donde se observe su integridad. Se necesita al menos 1 µg de DNA resuspendido en agua ultrapura o en tampón TE a una concentración final de 40-50 ng/µl. El DNA debe ser de buena calidad (A260/A280 entre 1,8 y 2)

Metodología

La metodología utilizada para la secuenciación parcial es la descrita en Arahal et al. (2008). El DNA se amplifica mediante PCR en un termociclador utilizando cebadores universales, 616V: 5´-AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG -3´, 699R: 5´-RGG GTT GCG CTC GTT -3´. Los productos de PCR se comprueban mediante electroforesis en gel de agarosa 1% (p/v) en tampón tris-borato EDTA a 135 V durante 25 minutos.

La metodología utilizada para la secuenciación completa es la descrita en Arahal et al. (2008) y Lucena et al. (2010). El DNA se amplifica mediante PCR, utilizando cebadores universales 616V: 5´- AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG -3´ y 699R: 5´- GGG TYK CGC TCG TTR -3´, para el extremo 5’ del gen, y los cebadores P609D: 5’ - GGMTTAGATACCCBDGTA -3’ y P1525R: 5’ - WAGGAGGTRATCCADCC -3’, para el extremo 3’. Los productos de PCR se comprueban mediante electroforesis en gel de agarosa 1% (p/v) en tampón tris-borato EDTA a 135 V durante 25 minutos.

La secuenciación de los fragmentos de PCR se lleva a cabo en un secuenciador ABI 3730xl (Applied Biosystems) utilizando los mismos cebadores de la PCR a una concentración de 5 nM.

El análisis de la secuencia del gen 16S rRNA se realiza utilizando las plataformas EzTaxon (Kim et al., 2012) y BLAST (Altschul et al., 1997). El resultado obtenido se presenta recogiendo la extensión del fragmento solapado, el porcentaje de semejanza y el número de acceso de la secuencia de la cepa tipo de la especie que presenta el mayor grado de identidad.

Bibliografía

Altschul SF, Madden TL, Schäffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 1997. 25, 3389-3402.

Arahal DR, Sánchez E, Macián MC, Garay E. Value of recN sequences for species identification and as a phylogenetic marker within the family “Leuconostocaceae”. Int Microbiol. 2008. 11: 33-39.

Kim OS, Cho YJ, Lee K, Yoon SH, Kim M, Na H, Park SC, Jeon YS, Lee JH, Yi H, Won S, Chun J.  Introducing EzTaxon: a prokaryotic 16S rRNA Gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species. Int J Syst Evol Microbiol. 2012. 62, 716-721.

Lucena T, Pascual J, Garay E, Arahal DR, Macián MC, Pujalte MJ. Haliea mediterranea sp. nov., a new marine gammaproteobacterium. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2010. 50, 1844-1848.

 
Esta página web utiliza cookies propias y de terceros con fines técnicos, de análisis del tráfico y para facilitar la inserción de contenidos en redes sociales a petición del usuario. Si continúa navegando, consideramos que acepta su uso. Para más información consulte nuestrapolítica de cookies