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La identificación se basa fundamentalmente en el análisis de una o dos regiones del DNA ribosómico: secuenciación de los dominios D1/D2 del gen 28S rRNA y/o de la región ITS (espacios intergénicos ITS1 e ITS2 y que incluye el gen 5,8S rRNA). Su comparación con las secuencias disponibles en las bases de datos públicas permite asignar las cepas a una especie concreta cuando el porcentaje de homología de sus secuencias es superior o igual a 99% (Kurtzman y Robnett, 1998) (Kurtzman, 2014).

Adicionalmente, la secuenciación de otros genes como actina, β-Tubulina y/o factor de elongación de la traducción 1α puede ofrecer un mayor nivel de resolución en determinados grupos de microorganismos. El análisis de dichas secuencias permite establecer relaciones filogenéticas y mejorar la identificación a nivel de especie en aquellas especies donde las regiones del DNA ribosómico no son suficientemente resolutivas. Los genes secuenciados dependen del taxón al que pertenece el aislado.

En el caso de hongos filamentosos la identificación también incluye un estudio morfológico para corroborar los resultados obtenidos en la identificación molecular y, en determinados casos, poder diferenciar entre especies.

Se emite un informe con los datos del análisis a nivel molecular.

En el caso de que el resultado obtenido no sea suficientemente discriminatorio para llegar a la identificación a nivel de especie, el personal de la CECT contactará con el cliente para informarle de los resultados obtenidos y de la posibilidad de mejorar la identificación utilizando otro tipo de técnicas.

Material necesario

El requisito fundamental para llevar a cabo la identificación es disponer de un cultivo puro del microorganismo

Metodología

Los cebadores utilizados para amplificar las diferentes regiones ribosómicas son:

  • Región ITS (ITS1 e ITS2 e incluye al gen 5,8S rDNA): its1-its5/its4 (White et al., 1990)
  • Dominios D1/D2 del extremo 5' del gen 28S rRNA: nl1/nl4 (O'Donnell et al. 1998)
  • Gen 28S rRNA (1,4Kb): LROR (Cubeta et al. 1991) y LR5 (Vilgalys & Hester, 1990). Cebadores internos: LR3R/LR3 (Vilgalys & Hester (1990)

Los productos de PCR se comprueban mediante electroforesis en gel de agarosa 1% (p/v) en tampón tris-borato EDTA a 135 V durante 25 minutos.

La secuenciación de los fragmentos de PCR se lleva a cabo en un secuenciador ABI 3730xl (Applied Biosystems) utilizando los mismos cebadores de la PCR a una concentración de 5 nM.

Se realiza un análisis Blast de las secuencias obtenidas frente a diferentes bases de datos (NCBI o MycoBank, ambos de acceso libre en red), recogiendo en el informe emitido la extensión del fragmento solapado, el porcentaje de semejanza y el nombre del microorganismo con un mayor grado de identidad de secuencia.

Bibliografía

Cubeta, M.A., E. Echandi, T. Abernethy & R. Vilgalys (1991). Characterization of anastomosis groups of binucleate Rhizoctonia species using restriction analysis of an amplified ribosomal RNA gene. Phytopathology 81:1395-400.

Kurtzman, C.P., & Robnett, C.J. (1998). Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences. Antonie van Leeuwenhoek, 73:331–371.

Kurtzman CP (2014). Use of gene sequence analyses and genome comparisons for yeast systematics. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 64:325–332.

O’Donnell, K., Cigelnik, E. & Nirenberg, H. I. (1998). Molecular systematics and phylogeography of the Gibberella fujikuroi species complex. Mycologia, 90:465–493.

Vilgalys, R. & M. Hester (1990). Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species. Journal of Bacteriology, 172:4238-4246.

White, T. J., T. Bruns, S. Lee, and J. Taylor (1990). Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, p. 315-322. In M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White (ed.), PCR protocols. A guide to methods and applications. Academic Press, San Diego, Calif

 
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