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La diferenciación de cepas a nivel subespecífico requiere de la aplicación de técnicas de tipificación molecular. En la CECT se utilizan las técnicas de RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) y de SSR (simple sequence repeat).

Técnica RAPD

El personal de la CECT tiene experiencia acumulada en la utilización de RAPDs para diferentes grupos bacterianos. Para hongos filamentosos y levaduras se utilizan habitualmente los cebadores del Kit A, Operon Technologies, Alameda, CA. (Gherbawy, 2005): OPA 2 (5’TGCCGAGCTG), OPA 3 (5’- AGTCAGCCAC), OPA 10 (5’GTGATCGCAG) y OPA 18 (5’AGGTGACCGT).

Técnica SSR

Con la técnica SSR se obtienen perfiles genéticos generados por amplificación mediante PCR de las regiones microsatélites. Las secuencias microsatélites son muy abundantes en los genomas de eucariotas y algunos procariotas. Son unidades cortas, de 1 a 6 pares de bases (motivos básicos), que se repiten en tándem un elevado número de veces. Su frecuencia y tipo de repetición varía en los genomas de distintas especies.

Los cebadores utilizados en la CECT son: SSR-TGT(5’ VHVTGTTGTTGTTGTTGT-3’) y SSR-MR(5’ GAGGGTGGCGGTTCT-3’) (Sigma).

Material necesario

Cultivo activo o DNA genómico de la cepa a caracterizar

Se necesitan más de 2 microgramos de DNA genómico a una concentración de 40 ng/µl suspendido en agua ultrapura o tampón TE, con valores de A260/A280 de entre 1,8 y 2. El DNA se ha de enviar en frío.

Metodología

Se cuantifica y ajusta la concentración del DNA para la reacción de PCR. Los fragmentos de PCR obtenidos son separados mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% (p/v) en tampón tris-borato EDTA a 100 V durante 90 minutos dando lugar a un patrón de bandas específico de cepa.

El resultado obtenido se presenta en forma de imagen en formato jpeg.

Bibliografía

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Ellegren H. (2004). Microsatellites: simple sequences with complex evolution. Nat.Rev. Genet., 5(6):435-445.

Helena Korpelainen, Kirsi Kostamo, and Viivi Virtanen. (2007). Microsatellite marker identification using genome screening and restriction-ligation. BioTechniques 42:479-486

Aylward, J.,Dreyer, L. L., Steenkamp, E.T., Wingfield, m.J. and Roets, F. (2014). Development of polymorphic microsatellite markers for the genetic characterisation of Knoxdaviesia proteae (Ascomycota: Microascales) using ISSR-PCR and pyrosequencing. Mycol Progress. DOI 10.1007/s11557-013-0951-1.

 
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