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Mediante la secuenciación automática se obtiene la secuencia de nucleótidos de una muestra de DNA, que puede estar clonado en un vector o ser directamente amplificado por PCR.

Son muchos los campos de aplicación de estas técnicas. Entre los más relevantes están los siguientes:

  • Investigación básica en biología molecular: por ejemplo, estudios filogenéticos y de evolución de los organismos.
  • Biomedicina: caracterización molecular de genes con relevancia clínica, detección de susceptibilidad genética a ciertos tipo de cáncer, detección de mutaciones en oncogenes, etc
  • Genética humana: diagnosis de enfermedades hereditarias. Consejo genético.
  • Medicina legal: identificación de individuos, pruebas de paternidad.
  • Microbiología: identificación de especias bacterianas.
  • Otros: conservación de especias en peligro de extinción, identificación de variedades en vegetales o virología.

Servicios que se ofrecen

  • Lecturas de más de 800 pb a partir de moldes de DNA de buena calidad mediante una única reacción de secuenciación. La longitud de la secuencia de DNA depende directamente de la calidad y de la cuantificación precisa del DNA molde.
  • Secuenciación de productos de PCR, plasmidos, fagos, etc. Las secuencias se obtienen utilizando los primers del usuario o primers estándar. Las reacciones de secuenciación se realizan a 50ºC, a menos que el usuario indique una temperatura específica para sus primers.
  • Los usuarios del servicio de secuenciación de ADN tienen la opción de realizar en su laboratorio el marcaje de las muestras para secuenciación con el acuerdo previo con el personal del laboratorio. En este caso en el laboratorio se realizará solo la electroforesis capilar.
  • Visualización, edición y valoración de la calidad de los resultados y envío por correo electrónico o vía FTP de los ficheros de las secuencias.
  • Determinación de la concentración de las muestras en caso de que no la realice el usuario.
  • Resultados en un máximo de 5 días desde la recepción de la muestra.

 

En la Guía para la secuenciación automática de ADN encontraréis información para llevar a cabo el proceso de secuenciación de DNA.

 

Preparación y requisitos de las muestras para secuenciación de DNA

  • Insertos clonados: Plásmidos/Lambda/Fagos:
    • Existen una serie de requisitos mínimos de calidad exigibles para el DNA que se va a secuenciar. Pueden utilizarse diferentes protocolos para la obtención del DNA, pero todos tienen que producir un DNA libre de RNA, de fenol, de sales, de etanol, de EDTA, proteínas, detergentes, etc. Cada usuario puede elegir su protocolo de purificación del DNA, según se adapte a las necesidades de su muestra y de su laboratorio.
    • El DNA molde puede estar liofilizado o en AGUA.
    • Se requiere una cantidad de 200 ng por reacción, a una concentración mínima de 50 ng/ml.
    • Indicar en el formulario de solicitud de análisis el tipo de vector, el tamaño del inserto y la concentración de la muestra. Procurar que el nombre de la reacción (muestra + primer), sea inferior a 8 caracteres. No utilizar signos de puntuación ni letras griegas.
    • Si no se indica la concentración de la muestra, enviar al menos 10 mL por cada reacción de secuenciación.
  • Productos de PCR:
    • En el caso de secuenciación directa de productos de PCR, éstos deben estar libres de subproductos, primers excedentes, dNTPs y sales. Se pueden seguir protocolos de limpieza, bien mediante filtración o purificación en columna (Quiaquick, Quiagen, Microcon, Millipore, ExoSAP, Amersham USB). También se puede utilizar la precipitación con acetato de amonio cuando la concentración total de los primers en la reacción de PCR no supera la de 5 pmol.
    • El DNA puede estar liofilizado o en AGUA.
    • Se requiere una cantidad de 20 ng por cada 100 bases en la longitud del fragmento, a una concentración mínima de 10 ng/ml.
    • Indicar la longitud del fragmento y su concentración.
    • Si no se indica la concentración de la muestra, enviar al menos 10 mL por reacción de secuenciación.
  • Primers:
    • La secuenciación se puede realizar con primers específicos del gen o con primers estándar. El servicio dispone de los iniciadores universales para vectores tales como M13FW, M13Rev, T3, T7 Promotor, T7 Terminador y SP6.
    • Los primers específicos deben estar en agua ultrapura a una concentración de 5 mM. Debe indicarse la temperatura de hibridación con el DNA molde para que los técnicos de la Sección puedan determinar la temperatura a la que se realizará el marcaje del DNA.
    • Remitir un volumen de al menos 2 mL por cada muestra que se quiera secuenciar.
Secuncias de los primers disponibles en el laboratorio
T3 Prom 5'-d(ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA)-3'
T7 Prom 5'-d(TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG)-3'
T7 Term 5’-d(GCT AGT TAT TGC TCA GCG G)-3'
PUC/M13 For (-47): 5'-d(CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC)-3'
PUC/M13 Rev (-45): 5'-d(TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C)-3'
SP6 5'-d(ATT TAG GTG ACA CTA TAG)-3'

Secuenciación de muestras marcadas

Los usuarios del servicio de secuenciación de DNA tienen la opción de realizar en su laboratorio el marcaje de las muestras para secuenciación previo acuerdo con el personal del laboratorio. En este caso, en nuestro laboratorio sólo se realizará  la electroforesis de las placas y si es necesario, el paso previo de eliminación del exceso de terminadores marcados.

Entrega de resultados

  • El plazo máximo de entrega del resultado de secuenciación es de 5 días desde la fecha de recepción.
  • Los datos de las secuencias serán transferidos electrónicamente, tanto el texto como los electroforegramas.
  • Si no tienes el software para interpretar los ficheros de los electroferogramas, existe una versión del programa Sequence Scanner que puedes bajarte de la página de ThermoFisher o del programa Chromas que puedes bajarte de la página de Technelysium.

Devolución de materiales

Los moldes sobrantes serán conservados un máximo de cuatro semanas a disponibilidad del usuario y se devolverán previa petición expresa del mismo. Tras este periodo se eliminarán.

Secuencias fallidas

Los procedimientos empleados se han diseñado para minimizar la variabilidad y la frecuencia de secuencias fallidas. No obstante se pueden producir fallos debido a tres tipos de causas:

  1. Características de las muestras, bien del molde bien de los iniciadores.
  2. Información insuficiente por parte del usuario.
  3. Error operativo del funcionamiento interno del servicio.

Las secuencias fallidas se facturan cuando se estima que las causas de error son del tipo a o b. Las producidas por errores del tipo c se repiten. Si la repetición vuelve a fallar se asumirá que no se trataba de un error operativo.

Causas de error

Las causas de error más habituales que se asocian con el DNA de partida son las siguientes:

  • Para muestras en vectores de clonación, la cepa bacteriana donde se propaga el molde puede afectar a su calidad. Se obtienen resultados fiables con DH1, DH5a, DH10B o XL1-blue. No son recomendables MV1190, HB101 y JM101.
  • Cantidad insuficiente de DNA molde. Se recomienda cuantificar el DNA mediante electroforesis, empleando diluciones y comparando con marcadores de masa conocida y comprobar la concentración y las impurezas mediante absorbancia a 260/280 nm.
  • Calidad del molde. Aunque para su preparación se hayan utilizado kits comerciales pueden permanecer impurezas que interfieran con la secuenciación. Para productos de PCR las impurezas más habituales son los fragmentos que copurifican con el molde como por ejemplo primer-dimer, que contienen sitios de unión para los cebadores de secuenciación.
  • Problemas con los cebadores específicos del molde. La muestra puede contener distintos sitios de unión, o el cebador no unirse al molde o cantidad insuficiente del cebador o error en el cálculo de la Tm, etc.
 

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