Mitjançant la seqüenciació automàtica s'obté la seqüència de nucleòtids d'una mostra de DNA, el qual pot estar clonat en un vector o ser directament amplificat per PCR.

Són molts els camps d'aplicació d'aquestes tècniques. Entre els més rellevants hi ha aquests:

• Investigació bàsica en biologia molecular: per exemple, estudis filogenètics i d'evolució dels organismes.
• Biomedicina: caracterització molecular de gens amb rellevància clínica, detecció de susceptibilitat genètica a certs tipus de càncer, detecció de mutacions en oncogens, etc.
• Genètica humana: diagnosi de malalties hereditàries. Consell genètic.
• Medicina legal: identificació d'individus, proves de paternitat.
• Microbiologia: identificació d'espècies bacterianes.
• Altres: conservació d'espècies en perill d'extinció, identificació de varietats en vegetals o virologia.

Serveis que s'ofereixen

• Lectures de més de 800 pb a partir de motlles de DNA de bona qualitat mitjançant una única reacció de seqüenciació. La longitud de la seqüència de DNA depèn directament de la qualitat i de la quantificació precisa del DNA motlle.
• Seqüenciació de productes de PCR, plasmidis, fags, etc. Les seqüències s'obtenen utilitzant els encebadors de l’usuari o encebadors estàndard. Les reaccions de seqüenciació es realitzen a 50ºC, tret que l'usuari indique una temperatura específica per als seus encebadors.
• Els usuaris del servei de seqüenciació de ADN tenen l'opció de realitzar en el seu laboratori el marcatge de les mostres per a seqüenciació amb l'acord previ amb el personal del laboratori. Al laboratori es realitzarà només l’ electroforesi capil·lar.
• Visualització, edició i valoració de la qualitat dels resultats i enviament per correu electrònic o via FTP del fitxers de les seqüències.
• Determinació de la concentració de les mostres en el cas que no la realitze l’ usuari.
• Resultats en un màxim de 5 dies des de la recepció de la mostra.

En la Guia per a la sequüenciació automàtica trobareu informació per a desenvolupar el procés de seqüenciació d’ADN.

Preparació i requisits de les mostres per a seüenciació de DNA

1. Inserits clonats: Plasmidis/Lambda/Fags:

• Hi ha una sèrie de requisits mínims de qualitat exigibles per al ADN que es va a seqüenciar. Poden utilitzar-se diferents protocols per a l'obtenció del ADN, però tots han de produir un ADN lliure de RNA, de fenol, de sals, d’etanol, d'EDTA, proteïnes, detergents, etc. Cada usuari pot triar el seu protocol de purificació del ADN, segons s'adapte a les necessitats del seu mostra i del seu laboratori.
• El ADN motlle pot estar liofilitzat o en AIGUA.
• Es requereix una quantitat de 200 ng per reacció, a una concentració mínima de 50 ng/µl.
• Indicar en el formulari de sol·licitud d'anàlisi el tipus de vector, la grandària de l'inserit i la concentració de la mostra si es coneix. Procurar que el nom de la reacció (mostra + encebador), siga inferior a 8 caràcters. No utilitzar signes de puntuació ni lletres gregues. Si no es coneix la concentració de la mostra, enviar al menys 10 µl d’ ADN per reacció de seqüenciació.

2. Productes de PCR:

• En el cas de seqüenciació directa de productes de PCR, aquests han d'estar lliures de subproductes, primers excedents, dNTPs i sals. Es poden seguir protocols de neteja, bé mitjançant filtració o purificació en columna (Quiaquick, Quiagen, Microcon, Millipore, ExoSAP, Amersham USB). També es pot utilitzar la precipitació amb acetat d'amoni quan la concentració total dels primers en la reacció de PCR no supera la de 5 pmol.
• El ADN pot estar liofilitzat o en AIGUA.
• Es requereix una quantitat de 20 ng per cada 100 bases en la longitud del fragment, a una concentració mínima de 10 ng/µl.
• Indicar la longitud del fragment i la seua concentració. Si no es coneix la concentració de la mostra enviar al menys 10 µl d’ ADN per reacció de seqüenciació.

• Encebadors:
• La seqüenciació es pot realitzar amb encebadors específics del gen o amb encebadors estàndard. El servei disposa dels iniciadors universals per a vectors com ara M13FW, M13Rev, T3, T7 promotor, T7 terminador i SP6.
• Els encebadors específics han d'estar en aigua ultrapura a una concentració de 5 µM. Ha d'indicar-se la temperatura d'hibridació amb el ADN motlle perquè els tècnics de la Secció puguen determinar la temperatura a què es realitzarà el marcatge del ADN. Remetre un volum d’ almenys 2 µL per cada mostra que es vulga seqüenciar.

Seqüenciació de mostres marcades

Els usuaris del servei de seqüenciació de ADN tenen l'opció de realitzar en el seu laboratori el marcatge de les mostres per a seqüenciació amb l'acord previ amb el personal del laboratori.

Entrega de resultats

• El termini d'entrega del resultat de seqüenciació és de 5 dies des de la data de recepció.
• Les dades de les seqüències seran transferides electrònicament .
• Si no tens el programari per a interpretar els fitxers dels electroferogramas, hi ha una versió del programa Sequence Scanner que pots baixar-te de la pàgina de ThermoFisher o del programa Chromas que pots baixar-te de la pàgina de Technelysium.

Devolució de materials

Els motlles sobrants seran conservats un màxim de quatre setmanes a disponibilitat de l'usuari i es tornaran prèvia petició expressa del mateix. Després d’ aquest període s'eliminaran.

Seqüenciències fallides

Els procediments emprats s'han dissenyat per a minimitzar la variabilitat i la freqüència de seqüències fallides. No obstant es poden produir per tres tipus de causes:

• a. Característiques de les mostres, bé del motlle bé dels iniciadors.
• b. Informació insuficient per part de l'usuari.
• c. Error operatiu del funcionament intern del servei.

Les seqüències fallides es facturen quan s'estima que les causes d'error són del tipus a o b. Les produïdes per errors del tipus c es repeteixen. Si la repetició torna a fallar s'assumirà que no es tractava d'un error operatiu.

Causes d'error

Les causes d'error més habituals que s'associen amb el ADN de partida són les següents:

• Per a mostres en vectors de clonatge, el cep bacterià on es propaga el motlle pot afectar la seua qualitat. S'obtenen resultats fiables amb DH1, DH5a, DH10B o XL1-blue. No són recomanables MV1190, HB101 i JM101.
• Quantitat insuficient d’ ADN motlle. Es recomana quantificar el ADN mitjançant electroforesi, emprant dilucions i comparant amb marcadors de massa coneguda i comprovar la concentració i les impureses mitjançant absorbància a 260/280 nm.
• Qualitat del motle. Encara que per a la seua preparació s'hagen utilitzat kits comercials poden romandre impureses que interfereixen amb la seqüenciació. Per a productes de PCR les impureses més habituals són els fragments que copurifiquen amb el motlle com per exemple primer dimers, que contenen llocs d'unió per als encebadors de seqüenciació.
• Problemes amb els encebadors específics del motlle. La mostra pot contenir distints llocs d'unió, o el encebador no unir-se al motlle o quantitat insuficient del encebador o error en el càlcul de la Tm, etc.