La PCR quantitativa és una modificació de la tècnica de PCR convencional que permet quantificar la quantitat inicial d'un fragment diana en present en la mostra original, ja siga DNA o RNA (cDNA).
En la Secció de Genòmica es poden aplicar dues metodologies de PCR quantitativa: PCR en temps real i PCR digital.
qPCR en Temps Real (qRT-PCR)
En teoria, hi ha una relació quantitativa entre la quantitat de la seqüència diana inicial i la quantitat del producte de PCR en qualsevol cicle de l'amplificació. Mitjançant la inclusió de fluorocroms es pot monitorar el progrés en temps real de la reacció d'amplificació, mesurant la fluorescència alliberada cada vegada que es realitza una còpia del DNA motle, ja que l'increment de la intensitat d'aquesta és proporcional a la quantitat de DNA generat.
Aplicacions:
- Estudis d'expressió gènica: quantificació absoluta amb corba patró i quantificació relativa amb gen control endogen.
- Detecció de SNPs.
- Detecció de patògens alimentaris.
- Determinació de la càrrega viral.
- Determinació de la malaltia mínima residual.
- Estudis de discriminació al·lèlica, etc.
Instrumentació
L'instrumental disponible en el laboratori és un equip Applied Biosystems model StepOne Plus que permet l'anàlisi de 96 mostres. Es pot realitzar la detecció simultània de més d'un fluoròfor i, per tant, la detecció de més d'un amplicon en un mateix tub. Es poden realitzar assajos amb SYBR Green o amb sondes marcades.
També es disposa del programa Primer Express per al disseny de sondes i primers.
Serveis que s'ofereixen
Els serveis que la secció ofereix als investigadors són els següents:
- Assessorament en el disseny de l'experiment i en l'anàlisi de les dades.
- Disseny de sondes i primers amb el programa Primer Express de Applied Biosystems.
Preparació i enviament de les mostres
L'usuari és el responsable de dur a terme les reaccions de PCR. En el laboratori de seqüenciació se li subministraran els tubs o plaques necessaris per a ser utilitzats en els equips, a més dels reactius SYBR Green PCR màster mix o TaqMan PCR màster mix, quan els sol·licite.
Els usuaris hauran de realitzar una sessió inicial d'entrenament en el laboratori del SCSIE abans de poder utilitzar l'equip.
Lliurament de resultats
S'entregarà a cada investigador una còpia del fitxer amb les dades, que poden ser analitzats instal·lant prèviament el programa proporcionat pels tècnics de la Secció de Genòmica.
