La PCR cuantitativa es una modificación de la técnica de PCR convencional que permite cuantificar la cantidad inicial de un fragmento diana en presente en la muestra original, ya sea DNA o RNA (cDNA).
En la Sección de Genómica se pueden aplicar dos metodologías de PCR cuantitativa: PCR en tiempo real y PCR digital.
qPCR en Tiempo Real (qRT-PCR)
En teoría, hay una relación cuantitativa entre la cantidad de la secuencia diana inicial y la cantidad del producto de PCR en cualquiera ciclo de la amplificación. Mediante la inclusión de fluorocromos se puede monitorizar el progreso en tiempo real de la reacción de amplificación, midiendo la fluorescencia liberada cada vez que se realiza una copia del DNA molde, puesto que el incremento de la intensidad de esta es proporcional a la cantidad de DNA generado.
Aplicaciones:
- Estudios de expresión génica: cuantificación absoluta con curva patrón y cuantificación relativa con gen control endógeno.
- Detección de SNPs.
- Detección de patógenos alimentarios.
- Determinación de la carga viral.
- Determinación de la enfermedad mínima residual.
- Estudios de discriminación alélica, etc.
Instrumentación
El instrumental disponible en el laboratorio es un equipo Applied Biosystems modelo StepOne Plus que permite el análisis de 96 muestras. Se puede realizar la detección simultánea de más de un fluoróforo y, por lo tanto, la detección de más de un amplicón en un mismo tubo. Se pueden realizar ensayos con SYBR Green o con sondas marcadas.
También se dispone del programa Primer Express para el diseño de sondas y primers.
Servicios que se ofrecen
Los servicios que la sección ofrece a los investigadores son los siguientes:
- Asesoramiento en el diseño del experimento y en el análisis de los datos.
- Diseño de sondas y primers con el programa Primer Express de Applied Biosystems.
Preparación y envío de las muestras
El usuario es el responsable de llevar a cabo las reacciones de PCR. En el laboratorio de secuenciación se le suministrarán los tubos o placas necesarios para ser utilizados en los equipos, además de los reactivos SYBR Green PCR máster mix o TaqMan PCR máster mix, cuando los solicite.
Los usuarios deberán realizar una sesión inicial de entrenamiento en el laboratorio del SCSIE antes de poder utilizar el equipo.
Entrega de resultados
Se entregará a cada investigador una copia del fichero con los datos, que pueden ser analizados instalando previamente el programa proporcionado por los técnicos de la Sección de Genómica.
PCR digital (dPCR)
Esta técnica permite la cuantificación absoluta de un DNA o cDNA sin necesidad de utilizar una curva patrón ni un gen control endógeno. Las moléculas de DNA o cDNA molde de la muestra se separan individualmente en particiones que funcionan como microcámaras en las que se realizan las reacciones de PCR en paralelo. Los productos específicos se detectan utilizando los mismos fluorocromos que en qPCR en tiempo real. Cuando en una partición está presente la secuencia diana, se amplifica y se genera señal (partición positiva). Si no se produce la amplificación se considera partición negativa. Aplicando una distribución de Poisson, la proporción de particiones positivas y negativas se utiliza para determinar de manera absoluta el número de moléculas diana en la muestra.
Aplicaciones:
- Cuantificación absoluta de carga viral
- Cuantificación de patógenos
- Generación de patrones de referencia
- Cuantificación de expresión génica
- Detección y cuantificación de GMOs
- Detección de mutaciones de baja frecuencia
- Cuantificación de quimeras donante/receptor
- Análisis CNV
- Confirmación de variantes detectadas por NGS
Instrumentación
El equipo de dPCR disponible en la Sección de Genómica es el modelo QuantStudio 3D de Life Technologies. El sistema de obtención de las particiones y de realización de las amplificaciones es un chip microfluídico de 20.000 pocillos.
El sistema permite la detección de más de un fluoróforo simultáneamente y se puede utilizar SYBR Green o sondas marcadas.
Servicios que se ofrecen
- Asesoramiento en el diseño del experimento y en el análisis de los datos.
- Realización del experimento
Preparación y envío de las muestras
- Consultar previamente con el personal de la sección
