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La sección de genómica ofrece el servicio de secuenciación masiva utilizando dos plataformas, SOLID 5500 XL (Life Technologies) y 454 GS Junior (Roche). Para este servicio se ofrece asesoramiento en el diseño del proyecto y en la elección de la tecnología más adecuada. Además, en el laboratorio se lleva a cabo todo el proceso de secuenciación desde la preparación de las librerías, PCR en emulsión y secuenciación en la plataforma elegida. Tras la obtención de los resultados proporcionamos el análisis primario de los datos obtenidos y ofrecemos análisis bioinformáticos avanzados.

Solid 5500XL

Esta plataforma permite la secuenciación masiva en paralelo de fragmentos de DNA clonalmente amplificados y unidos a “beads”. La metodología de secuenciación se basa en la ligación secuencial de sondas fluorescentes. Se obtienen secuencias de hasta 75 nt. También se puede realizar la secuenciación pair-end lo que permite la obtención de dos secuencias de cada fragmento 75nt en la dirección directa y 35 nt en la dirección reversa.

Características de la plataforma

  • Exactitud de secuencia del 99.99 % de promedio.
  • Longitud de lectura:
    • Secuenciación “single read”: 35-75 nt.
    • Secuenciación pair-end: 75+35 nt.
  • Exact Call Chemistry (ECC) para “single read”: se obtienen lecturas en bases.

Aplicaciones

RNA-Seq

  • Secuenciación de transcriptomas:
    • Expresión de todos RNAs, codificantes y no codificantes.
    • Identificación de “splicing” alternativo.
    • Identificación de cSNPs.
    • Identificación de patrones de expresión específicos de alelo.
    • La preparación de las librerías permite identificar la cadena correspondiente a cada secuencia.
  • Secuenciación de small RNA: obtención del perfil de miRNA de las muestras e identificación de nuevos miRNA.

DNA-Seq

  • Secuenciación de exomas:
    • Enriquecimiento de exoma completo con la tecnología de Agilent whole exome sure select o similares.
    • Secuenciación y mapeo. Detección de mutaciones: SNPs, indels, cSNPS.
  • Resecuenciación de genomas completos:
    • Detección de mutaciones: SNPs, indels, cSNPS.
  • Otras aplicaciones: consultar con el personal del laboratorio.

Requisitos de las muestras

  • Todo el proceso de secuenciación: preparación de las librerías, PCR en emulsión y secuenciación, se realizará por el personal del laboratorio.
  • Muestras de DNA:
    • Proporcionar de 100 ng a 5 μg en 10-100 μl de agua libre de nucleasas o lowTE.
    • Las muestras deben estar libres de cualquier tipo de contaminante. Realizar la purificación utilizando columnas (Qiagen o similares), AMPure Beads (Beckman Coulter) o precipitación con etanol. En este último caso eliminar completamente las trazas de etanol para que no interfiera en los pasos enzimáticos de preparación de las librerías.
    • Cuantificar las muestras de manera precisa. Es mejor utilizar un método fluorimétrico por ejemplo Quant-IT (Qubit, Invitrogen), que por espectrofotometría.
    • Proporcionar una imagen del gel de agarosa de las muestras para confirmar la integridad de las mismas. El DNA genómico debe observarse como una única banda>12 kb.
    • Si la muestra es cDNA, indicar el método utilizado para su síntesis.
  • Muestras de RNA:
    • Las muestras deben estar libres de cualquier tipo de contaminante. Realizar la purificación utilizando columnas (Qiagen RNeasy, Invitrogen Ribominus o similares), o precipitación con etanol. En este último caso eliminar completamente las trazas de etanol para que no interfiera en los pasos enzimáticos de preparación de las librerías. Eluir o resuspender el RNA en agua libre de RNasas.
    • Para eliminar trazas de gDNA puede ser necesario el tratamiento con DNasaI
    • Cuantificar las muestras de manera precisa. Utilizar un método fluorimétrico por ejemplo Quant-IT (Qubit, Invitrogen) o el equipo Bioanalyzer 2100 de Agilent.
    • Se recomienda utilizar muestras de RNA total con un valor de RIN>7 para proceder a la eliminación de rRNA o el enriquecimiento en mRNA.
    • Cantidades requeridas de RNA en agua libre de RNasas:
Tipo de RNA Cantidad requerida
RNA total >10 μg en 10-20 μl
"rRNA-depleted" RNA >0.5 μg en 10 μl
RNA enriquecido en mRNA >0.5 μg en 10 μl
smallRNA consultar

454 GS Junior

Servicios de secuenciación masiva

El equipo GS Junior es una versión “mini” del 454 GS FLX. La metodología de secuenciación es la pirosecuenciación. Se obtienen secuencias de 400 nt.

Características de la plataforma

  • 120.000 lecturas promedio de cobertura para secuenciación shot-gun.
  • 90.000 lecturas promedio para secuenciación de amplicones.
  • Longitud media de lectura 400 bases.
  • Exactitud de secuencia del 99 %.
  • Capacidad de multiplexado de muestras mediante utilización de códigos de barras.

Aplicaciones

  • Secuenciación de novo de genomas microbianos, genomas virales y genomas pequeños.
  • Secuenciación de amplicones (producto de PCR).
  • Metagenómic.
  • Secuenciación de 16S.
  • Secuenciación de HIV, BRCA, etc.
  • Secuenciación de cDNA.
  • Otras aplicaciones: consultar con el personal del laboratorio.

Requisitos de las muestras

  • Librerías shot-gun o paired-end:
    • Las muestras deben estar libres de cualquier tipo de contaminante. Realizar la purificación utilizando columnas (Qiagen o similares), AMPure Beads (Beckman Coulter) o precipitación con etanol. En este último caso eliminar completamente las trazas de etanol para que no interfiera en los pasos enzimáticos de preparación de las librerías.
    • Cuantificar las muestras de manera precisa. Es mejor utilizar un método fluorimétrico por ejemplo Quant-IT (Qubit, Invitrogen), que por espectrofotometría.
    • Proporcionar una imagen del gel de agarosa de las muestras para confirmar la integridad de las mismas. El DNA genómico debe observarse como una única banda>12 kb.
Tipo de librería Cantidad DNA requerida
Fragmentos 3 μg en 100 μl
Paired-end 3 kb 10 μg en 100 μl
Paired-end 8 kb 20 μg en 100 μl
Paired-end 20 kb 50 μg en 100 μl
  • Si la muestra es cDNA, indicar el método utilizado para su síntesis.
  • Librerías de amplicones:
    • Las condiciones de PCR han de estar optimizadas para asegurar que sólo se produce la amplificación de un único fragmento del tamaño deseado. Si no es así recomendamos seleccionar el tamaño del amplicón de interés en un gel de agarosa o metodología similar.
    • Las muestras deben estar libres de cualquier tipo de contaminante. Realizar la purificación utilizando columnas (Qiagen o similares), AMPure Beads (Beckman Coulter). Realizar la elución en agua libre de nucleasas.
    • Tras la purificación, evaluar la calidad de las muestras en un gel de agarosa al 2%. Incluir una imagen del gel al enviar las muestras.
    • Cuantificar las muestras de manera precisa. Es mejor utilizar un método fluorimétrico por ejemplo Quant-IT (Qubit, Invitrogen), que por espectrofotometría.
    • Proporcionar 100 ng de DNA amplificado en 10-20 μl de agua por muestra.
    • Necesitamos información sobre el diseño del amplicón: indicar para cada muestra la secuencia completa de los primers directo y reverso incluyendo adaptador, MID y primer específico del amplicón.
 
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